斑点印迹杂交ppt课件
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பைடு நூலகம்
2h。变性DNA与探针结合
5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1预热到
42℃），每次5min；再将洗液2 (每次5ml）洗膜两次（预热
到42℃），每次15min。洗去未结合的探针，否则本底会太高 6 封闭：倒掉洗液2，加入5ml封闭液，37℃作用15min。封闭杂交
膜上非特异性的蛋白结合位点
7
酶联抗体结合：倒掉封闭液，加入 3ml亲和素-辣根过氧化物 酶（HRP），于37℃轻轻振摇30min。酶联抗体与生物素结合
8 洗膜：倒掉第七步骤中液体，加入 5ml洗液3，洗膜三次，每次 2-3min。洗去未结合的酶联抗体
9 显色：洗膜后，加3ml的显色液避光显色1-2min，斑点出来后
就可倒掉显色液，用ddH20冲洗几次，终止显色。
• 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，
室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合牢固 1 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。加入预杂交液3ml。
置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结
合位点
2 杂交：加入探针3ml（生物素-DNA），置42 ℃恒温床上，轻轻振荡1-
缝形则称为狭缝杂交。
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点样，
变性，中和，干燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交
结果等步骤，相对southern印迹杂交和Northern印记杂交
来说快，适合于同时分析多个样品。
实验步骤：
1 变性：按8:1将80ul ddH2O加入至10ul待测DNA样品中，稀释样品。 100℃加热10min后，立即置于冰中5min（使DNA变性），加入90ul 20×SSC混匀。
斑点印迹杂交
实验目的
掌握斑点印迹杂交的原理及方法
实验原理
杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及
离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）
上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未结合的探针），放射自 显影，判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改 变的检测。根据点样磨具不同，点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭
斑点杂交预期结果图
制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪 或直接点样）
NCF 滤纸 支撑板 至真空泵 点样板
96孔 12×8
废液储槽
2h。变性DNA与探针结合
5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1预热到
42℃），每次5min；再将洗液2 (每次5ml）洗膜两次（预热
到42℃），每次15min。洗去未结合的探针，否则本底会太高 6 封闭：倒掉洗液2，加入5ml封闭液，37℃作用15min。封闭杂交
膜上非特异性的蛋白结合位点
7
酶联抗体结合：倒掉封闭液，加入 3ml亲和素-辣根过氧化物 酶（HRP），于37℃轻轻振摇30min。酶联抗体与生物素结合
8 洗膜：倒掉第七步骤中液体，加入 5ml洗液3，洗膜三次，每次 2-3min。洗去未结合的酶联抗体
9 显色：洗膜后，加3ml的显色液避光显色1-2min，斑点出来后
就可倒掉显色液，用ddH20冲洗几次，终止显色。
• 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，
室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合牢固 1 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。加入预杂交液3ml。
置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结
合位点
2 杂交：加入探针3ml（生物素-DNA），置42 ℃恒温床上，轻轻振荡1-
缝形则称为狭缝杂交。
斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点样，
变性，中和，干燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交
结果等步骤，相对southern印迹杂交和Northern印记杂交
来说快，适合于同时分析多个样品。
实验步骤：
1 变性：按8:1将80ul ddH2O加入至10ul待测DNA样品中，稀释样品。 100℃加热10min后，立即置于冰中5min（使DNA变性），加入90ul 20×SSC混匀。
斑点印迹杂交
实验目的
掌握斑点印迹杂交的原理及方法
实验原理
杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及
离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）
上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未结合的探针），放射自 显影，判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改 变的检测。根据点样磨具不同，点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭
斑点杂交预期结果图
制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪 或直接点样）
NCF 滤纸 支撑板 至真空泵 点样板
96孔 12×8
废液储槽