2019年miRNA在基因表达调控中的作用.ppt
调节基因表达的miRNA机制探究
调节基因表达的miRNA机制探究近年来，生命科学领域的一个新兴研究方向——基因调节机制备受关注。
作为一种非编码RNA，miRNA可以通过针对mRNA的不完全匹配与其结合，从而抑制或降解mRNA，调节基因表达水平。
miRNA作为一种基因调节机制，其制约基因表达市场和功能失调的发生密不可分。
因此，本文将基于miRNA与调节基因表达的关系，深入对miRNA机制调节基因表达进行探究。
miRNA的发现与分类miRNA最初是在1993年由MiR20研究组在C.elegans线虫中发现的一类短RNA，后来被证明在多种生物中都有分布。
目前已有数千种miRNA被发现，其中以人类和小鼠为研究对象较多。
miRNA虽然具有多样性，但它们都具有类似的结构和功能，在细胞内调节基因表达方面起着重要的作用。
miRNA的结构为一条大约20-24个核苷酸的RNA碱基链。
由于miRNA不能完全与mRNA匹配，其结合位点往往是相对于mRNA的3'UTR区域。
miRNA与mRNA的结合可以从不同层面上对mRNA进行调节，如促进其降解或抑制其翻译的进行。
miRNA的发现虽然是由果蝇、线虫等模式生物开始的，但是随着miRNA研究的不断深入，人们已经发现了众多与miRNA相关的疾病，如乳腺癌、肝癌、肺癌等。
在这些疾病中，miRNA的表达模式往往与正常组织显示出截然不同。
因此，miRNA可以被视为一种基因调节机制，不仅参与了正常生理过程，也与各种疾病的发生存在较密切的关联。
miRNA的生物合成过程miRNA与mRNA的结合主要是靠RNA诱导RNA干涉机制（RNAi）实现的。
miRNA的生物合成过程包括以下几个步骤：miRNA基因在转录后形成初生miRNA；初生miRNA进一步被酵母物DICER切割成成熟的miRNA；miRNA通过与RNA的诱导复合物（RISC）结合，在靶网址结合至mRNA的3’UTR区域，进而实现mRNA的调节。
在miRNA生物合成过程中，与基因调节联系最为紧密的是miRNA的转录调节。
miRNA在蛋白质表达控制中的应用
miRNA在蛋白质表达控制中的应用蛋白质是细胞内的重要功能分子，其表达水平的调控对于维持正常的生物学过程至关重要。
过去，科学家主要通过调控转录过程来控制蛋白质表达。
然而，随着科技的发展，研究人员逐渐认识到microRNA （miRNA）在蛋白质表达调控中的重要作用。
miRNA是一类由RNA分子组成的非编码小分子，可以通过与靶基因mRNA结合来抑制其翻译或降解，从而影响蛋白质的表达水平。
本文将详细讨论miRNA在蛋白质表达控制中的应用。
1. miRNA的发现和作用机制miRNA最早于1993年被发现，进一步的研究表明它们在调控基因表达方面起着关键作用。
miRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ合成，形成一个短链RNA前体分子。
通过Dicer酶的作用，这个前体分子进一步裁剪成约20-22个核苷酸的成熟miRNA。
成熟的miRNA通过与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）结合，可以抑制靶基因的翻译或促进其降解。
2. miRNA在正常细胞中的调控作用miRNA在正常细胞中扮演着重要的调控角色。
研究发现，miRNA参与调节细胞的增殖、分化和凋亡等生命过程。
例如，在胚胎发育中，miRNA可以促进胚胎干细胞的定向分化，使其形成不同的器官和组织。
此外，miRNA还可以参与调控细胞周期和细胞凋亡，从而维持正常的细胞功能。
3. miRNA在疾病中的功能和应用miRNA的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关。
研究人员发现，在多种肿瘤类型中，miRNA的表达模式明显异常。
有些miRNA 被称为“肿瘤抑制miRNA”，其低表达与肿瘤的恶性程度相关。
另一些miRNA则被称为“肿瘤促进miRNA”，其高表达与肿瘤的发生和转移有关。
通过调节肿瘤相关miRNA的表达水平，研究人员可以干预肿瘤的发展。
此外，miRNA还被发现与心脏病、肝病、神经系统疾病等多种疾病的发生发展密切相关。
4. miRNA作为治疗靶点的前景miRNA调控蛋白质表达的特点使其成为治疗疾病的潜在靶点。
mirna作用原理
mirna作用原理一、引言mirna（microRNA）是一类长度约为20~24个核苷酸的非编码RNA分子，是细胞内调控基因表达的重要因素。
在哺乳动物中，mirna可通过与mRNA靶标相互作用，调控基因转录、剪接和蛋白翻译等过程。
二、mirna的合成与成熟mirna的合成经历多个步骤，包括转录、成熟和靶标识别等过程。
具体步骤如下：2.1 转录mirna基因位于基因组的非编码区域，与mRNA的转录有所不同。
mirna的转录通常由RNA聚合酶II进行，但其转录起始位点可被辅助序列、转录因子和启动子等调控。
转录后的初始转录物被称为pri-mirna。
2.2 剪接和修饰pri-mirna在细胞核内由核酸酶Drosha切割生成前体mirna（pre-mirna）。
pre-mirna包含一个带有长的发夹结构，该结构可保护mirna序列免受核酸酶RNase的降解。
随后，pre-mirna被转运至胞质。
2.3 Dicer酶的介入在胞质中，pre-mirna被RNase III类酶Dicer切割，生成成熟的双链mirna （mature mirna）。
Dicer酶通过识别pre-mirna的发夹结构，切割出成熟mirna 序列。
2.4 修饰与装配成熟mirna的两个链的两端均会发生修饰，包括磷酸化和甲基化。
此外，成熟mirna还与Argonaute（AGO）蛋白相结合，形成RNA诱导沉默复合物（RISC），以实现靶向调控。
三、mirna的作用机制mirna通过与mRNA靶标相互作用，调控基因表达。
其作用机制主要包括激活RNase 活性和抑制翻译两种方式。
3.1 miRNA结合靶标mRNAmirna通过与mRNA的3’非翻译区（3’ UTR）相互作用，形成RNA复合物。
该相互作用主要通过mirna的5’末端6-7个碱基与mRNA的靶标区域互补配对。
3.2 激活RNase活性当mirna与mRNA结合时，mirna可以作为引导RNA，将RNA诱导沉默复合物（RISC）靠近目标RNA。
miRNA在生物生长发育过程中起到的作用以及其作用机理
王昭元，海南师范大学生命科学学院。
的前体 ｍｉＲＮＡ。 含有茎环结构的前体 ｍｉＲＮＡ 再次经过 ＤＣＬ
蛋白 的 剪 切， 形 成 长 度 在 ２０ｂｐ 左 右 的 双 链 ｍｉＲＮＡ。 双 链
ｍｉＲＮＡ 分子在 ｍｉＲＮＡ 甲基酶的转移酶的作用下，在 ｍｉＲＮＡ
分子的 ３’ 末端进行甲基化修饰，这种修饰能够防止转移酶
和聚合酶的活性。 研究发现，成熟的 ｍｉＲＮＡ 都是以单链的
中对细胞的生长和凋亡的作用并不相同。
参考文献：
［１］ 秦耀旭，张关元，刘司奇，等． 植物重金属胁迫相关
ｍｉＲＮＡ 的研究 进 展 ［ Ｊ］ ． 分 子 植 物 育 种 官 方 网 站， ２０１９， １７
（９） ．
［２］ 王洁，章嘉航，孟秋峰，ｅｔ ａｌ． 植物 ｍｉＲＮＡ 研究进展
［ Ｊ］ ．宁波农业科技，２０１９（３） ：２５－２８．
同物种 中 鉴 定 到 数 以 万 计 的 ｍｉＲＮＡ 基 因， 同 时 随 着 对
ｍｉＲＮＡ 基因功能的深入研究，发现 ｍｉＲＮＡ 在动植物的生物
学过程中扮演重要的角色。
二、 ｍｉＲＮＡ 的生物合成过程
成熟的 ｍｉＲＮＡ 是初始转录物在一系列核酸酶经过剪切
加工而形成的。 虽然动植物中都存在 ｍｉＲＮＡ，但其形成方式
表达，进而调节种子的萌发。 此外，研究人员还发现过表达
ｍｉＲ１５６ 的拟南芥植株，其叶片的数量增加，且开花的时间延
迟，同时其顶端优势不明显。 相似的报道在番茄中也被发
现，当在番茄中过表达 ｍｉＲ１６７ａ 后，其下游的靶基因生长素
响应因子 ＡＲＦ６ 和 ＡＲＦ８ 的表达量下降，从而导致番茄的花
器官发育以及雌配子的育性出现异常。 ｍｉＲＮＡ 除了在植物
[课件]miRNA$lncRNA(mirna 和lncrna 的简介)PPT
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作用原理
作用结果
• miRNA与靶mRNA匹配完全，则该复合体降解mRNA • 若两者序列部分匹配，尤其是miRNA的5’端2-8个被称为 种子序列（seed sequence）的核苷酸与靶mRNA匹配完 好，则通过抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因。 • 某些miRNA，如miRNA－16能够特异结合于某些基因 3’UTR的富含AU元件（AU rich element,ARE）,指导Ago 等组成RISC区的蛋白与TTP(三磷酸胸苷）结合，从而改 变相应mRNA的半衰期，加速靶mRNA的降解。
• TargetScan
• 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的 microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率 较低的软件。
• Starbase • starBase is designed for decoding Interaction Networks of lncRNAs, miRNAs and mRNAs from largescale CLIP-Seq (HITS-CLIP, PAR-CLIP, iCLIP, CLASH) data and tumor samples (14 cancer types, >6000 samples). • starBase is also developed for deciphering miRNAtarget interactions, such as miRNA-lncRNA, miRNAmRNA, miRNA-circRNA, miRNA-pseudogene, miRNAsncRNA interactions from 108 CLIP-Seq datasets. • starBase provides miRFunction web tools to predict the function of ncRNAs
miRNA及其发展和应用
出核：pre-miRN被Exportin-5转运至细胞质
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剪接：由Drosh和DGCR8组成的核酶复合体在核内将pri-miRN剪切成约70个核苷酸的前体miRN（pre-miRN）
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转录：由RN聚合酶II在基因组DN上转录生成初级miRN（pri-miRN）
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作用：RISC复合体通过碱基配对识别并结合靶基因的mRN导致靶基因mRN的降解或翻译抑制从而实现基因表达的调控。
miRN与非编码RN在基因表达调控中的作用
miRN与非编码RN在细胞信号通路中的作用
提高miRN研究和应用的转化率解决实际应用中的挑战
提高miRN的稳定性和表达效率
开发新型miRN递送系统
研究miRN在疾病治疗中的作用机制
解决miRN在临床应用中的伦理和法律问题
汇报人：
感谢您的观看
早期miRN研究的主要成果
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发现miRN：1993年科学家首次发现miRN的存在
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发现miRN在发育中的作用：2004年科学家发现miRN在发育中的作用包括胚胎发育、器官形成等
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发现miRN在疾病中的作用：2003年科学家发现miRN在疾病中的作用包括癌症、心血管疾病等
添加标题
发现miRN的调控机制：2002年科学家发现miRN的调控机制包括miRN的生成、加工和作用机制
添加标题
发现miRN的生物合成途径：2000年科学家发现miRN的生物合成途径
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确定miRN的功能：1998年科学家确定miRN在基因表达调控中的作用
miRN的初步认识
发现：1993年科学家在秀丽隐杆线虫中发现了miRN
功能：miRN是一种非编码RN可以调控基因表达
mirna作用原理
mirna作用原理miRNA是一类长度约为20-22个核苷酸的小分子RNA，它们通过与mRNA靶标结合来调节基因表达。
miRNA在多种生物过程中发挥重要作用，包括胚胎发育、细胞增殖和分化、细胞凋亡、代谢调节等。
miRNA的生成过程包括两个主要步骤：首先，在细胞核中，Drosha 和DGCR8复合物将长的pri-miRNA切割成较短的pre-miRNA；然后，pre-miRNA转运到细胞质中，在那里Dicer复合物将其切割成成熟的miRNA。
miRNA与RISC（RNA诱导靶向复合物）结合形成miRISC，并通过与mRNA靶标结合来调节基因表达。
miRISC通过识别mRNA序列上的互补区域来选择性地结合到mRNA 上。
这些互补区域通常位于mRNA 3'非翻译区域（UTR）上，并且与miRNA序列的3'末端相互匹配。
当miRISC与mRNA结合时，它可以通过不同机制调节基因表达。
其中一种机制是抑制mRNA翻译，即通过阻止ribosome与mRNA结合来阻止蛋白质合成。
另一种机制是降解mRNA，即通过切割mRNA来降解它，从而防止蛋白质合成。
miRNA的作用可以被调节和影响。
例如，一些miRNA的表达水平可以受到转录因子和表观遗传修饰的影响。
此外，与miRNA结合的蛋白质也可以影响miRNA的功能。
例如，AGO2（Argonaute 2）是RISC中最重要的组分之一，它与miRNA结合并参与调节基因表达。
总之，miRNA通过与mRNA靶标结合来调节基因表达，并在多种生物过程中发挥重要作用。
了解miRNA的生成、结构和功能对于深入理解基因调控机制以及开发相关治疗方法具有重要意义。
microRNA研究课件
Microrna与mRNA的相互作用分析
总结词
互补配对分析，结合位点预测，转录本水平调节，翻 译水平调节。
详细描述
通过互补配对分析，研究Microrna与mRNA的碱基配 对规则以及作用力大小。利用结合位点预测方法，推 测Microrna与mRNA的结合位点及其附近的序列和结 构特征。转录本水平调节是指Microrna通过与靶基因 mRNA的3'UTR结合，抑制或下调靶基因转录物的生 成
Microrna与肿瘤
Microrna参与肿瘤细胞增殖和凋亡过程
通过调节细胞周期、抑制凋亡等途径参与肿瘤的发生发展。
Microrna与信号转导通路
调节肿瘤细胞信号转导通路，如PI3K/Akt、MAPK等，促进或抑制肿瘤细胞的生长和迁移。
Microrna与肿瘤细胞转移
参与肿瘤细胞的侵袭和转移过程，如调节细胞黏附、细胞外基质降解等。
Microrna与自身免疫性疾病
Microrna与自身免疫性 疾病的发病
通过调节免疫细胞功能、影响炎症反应等途 径参与自身免疫性疾病的发病过程。
Microrna与自身免疫性 疾病的诊疗
为自身免疫性疾病的诊断提供新的生物标志 物，并为治疗提供潜在靶点，有助于改善诊
疗效果。
04
Microrna的提取、检测方法
06
研究Microrna的实验设计及伦理问 题
实验设计原则及注意事项
要点一
基于科学问题的实验 设计
针对具体的科学问题，设计实验方案 ，确保研究的科学性和可靠性。
要点二
对照原则
设立对照组，以排除非实验因素对实 验结果的影响，提高研究的可信度。
要点三
随机原则
采用随机抽样方法，减少系统误差和 偏倚，提高研究的普遍性和可推广性 。
miRNA在疾病中的作用及其调控机制研究
miRNA在疾病中的作用及其调控机制研究近年来，人们在多个领域都不断地探索，寻找与疾病关联的因素，其中，细胞内的多种RNA分子也成为了研究的重点之一。
作为非编码RNA的一个重要分支，miRNA（microRNA）在众多细胞活动及疾病发生发展中起着至关重要的作用。
一、miRNA在疾病中的作用miRNA是一类长度约为20～24个核苷酸、单链的RNA分子，可在靶基因的3’非编码区（3’-untranslated region, 3’-UTR）结合，并通过与靶基因mRNA的互补配对，实现其中的RNA干扰作用。
miRNA与其靶基因的结合，可导致靶基因的转录水平降低及mRNA降解，甚至进一步影响蛋白翻译、跨膜转运和稳定性等。
与此同时，miRNA结合后对靶基因的抑制作用通常发挥在其表达水平较低、非常规表型异常以及重要的细胞信号传导途径等关键环节上。
所以miRNA的控制通常具有一定的剂量效应，也对其本身所调控的基因表达及信号通路产生多方面的影响。
不同于其他形态的RNA，miRNA具有较为广泛的组织分布，可在细胞核、细胞浆及外泌体等细胞构成中进行调控。
在疾病过程中，该分子的异常表达与多种疾病的发生息息相关，如所表达的miRNA类型与亚型等中发现了癌症、神经退行性疾病、心血管疾病、炎症反应等等疾病的明显联系。
同时，其代谢通路的研究也逐渐加深了对各类相关疾病发生发展的认知。
以癌症为例，miRNA在肿瘤细胞中的表达特点、分布规律及其调控机制等，已成为现有研究的热点之一。
之前的研究发现，肿瘤细胞中的miRNA表达模式与其正常对应组织细胞发生了明显的变化。
miRNA在肿瘤细胞中的表达，通常与固有的肿瘤特征及其临床表现密不可分。
比如，前列腺癌中被鉴定出的miR-21，通过抑制下游靶基因的相关调节蛋白而促进该肿瘤细胞的增殖。
而以miRNA的靶向作用为线索，此后的研究者也陆续探索出了肿瘤细胞中存在的其他具有抑制作用的miRNA类型。
miRNA 靶基因识别和功能调节
• （2）从蛋白质水平寻找miRNA靶基 因
• 由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过 程不引起mRNA水平的改变，因此依据 mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的 方法在检出率上存在一定问题。 Selbach[13]和Baek[14]两个研究组分别利 用蛋白质组学的研究方法，建立了从蛋 白质水平寻找miRNA靶基因的新方法。
SiRNA与mRNA比较
• SiRNA和mRNA也有区别。1.根本区别是miRNA是内源 的，在基因组中有固定的基因座位；siRNA可以是人 工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片 断和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于 siRNA没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能 片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。2.二者 结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA， miRNA转录出来时必然是发夹状的，siRNA可以由完 全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。
• 各不同算法各有其特点，主要还是依据 miRNA与其靶位点的互补性、miRNA靶 位点的保守性、miRNA-‐mRNA双链之
间的热稳定性及附近序列的二级结构等 原则设计的。其中，miRanda是将 miRNA-‐mRNA之间的序列匹配，保守
性及热稳定性作为计算参数，有比较好
的检出率，但是假阳性率也较高； TargetScan提出了“种子区”的概念，增 加了预测的精确度。
• 在核酸酶Drosha及其辅助因子Pasha的作 用下，pri-miRNA被处理成70个核苷酸组 成具有茎环结构的pre-miRNA，然后由 Exportin 5等转运至细胞质。Dicer将premiRNA切割成约22nt的双链miRNA。
• 双链miRNA讲解形成单链的成熟miRNA。 成熟miRNA还需要与Argonaute蛋白等组 装形成RNA诱导沉默复合体（RISC）， RISC作用于特异mRNA的3’UTR，从而 抑制翻译过程或者直接降解mRNA。
microRNA研究课件
疫苗开发
microrna也可以应用于疫苗开发。通过向 细胞中导入特定microrna，可以调节免疫 反应，增强机体对病原体的抵抗力，从而 达到预防和治疗疾病的目的。例如，某些 microrna可以作为疫苗佐剂使用，增强机 体的免疫应答和疫苗效果。
05
研究microrna的方法学
基于生物化学的方法
调节细胞增殖和凋亡
microrna可以调节细胞增殖和凋亡 过程，影响肿瘤的发生和发展。
调节免疫应答
microrna可以调节免疫应答反应， 影响炎症和自身免疫性疾病的发生 和发展。
02
microrna的生物合成及调节机制
microrna的生物合成
细胞核内microrna的生物合成
microrna基因首先在细胞核内被转录成初级转录物（pri-miRNA），然后被核酸酶Drosha和其辅助因子 Pasha加工成约70个核苷酸长的pre-miRNA，最后在核酸酶Dicer的作用下剪切并修饰形成成熟的microrna。
分子克隆技术：用于microrna的 cDNA克隆和序列分析。
Northern印迹杂交：检测microrna在 mRNA水平上的表达。
细胞和组织中microrna的表达：通 过原位杂交和组织芯片技术观察。
基于分子生物学的方法
01
基因组学技术
02
报告基因法
分析microrna基因组的位置和结构。
研究microrna对靶基因的调控作用。
定义
microrna是一类非编码RNA分子，由21-25个核苷酸组成， 通过与靶mRNA结合调节基因表达。
特点
microrna在生物体内具有高度保守性和稳定性，参与多种生 物学过程，包括发育、细胞增殖、凋亡和免疫应答等。
miRNA在DNA甲基化和去甲基化中的作用
miRNA在DNA甲基化和去甲基化中的作用生命的起源和发展都源于生物分子的相互作用和调控，而DNA甲基化和去甲基化一直被认为是基因表达调控的主要方式之一。
DNA甲基化是指DNA分子上附加一个甲基基团，通常发生在CpG二核苷酸上。
DNA去甲基化则是将这个甲基基团从DNA分子中去除的过程。
过去，科学家们认为这个过程是依靠酶类完成的，但是最近的研究表明，小分子RNA（miRNA）在这一过程中也起着至关重要的作用。
miRNA是一种长度为约22个核苷酸的非编码RNA，它们通过与靶向mRNA分子相互作用来调控基因表达。
miRNA可以通过多种机制来影响DNA甲基化和去甲基化。
下面将对miRNA在这两个过程中的作用进行详细分析和探讨。
miRNA在DNA甲基化中的作用DNA甲基化主要由三个酶类完成：DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）、DNA去甲基化酶（TDG和TDAG1）和甲基化读取蛋白。
miRNA能够通过多种方式来调控这些酶类的表达和功能，从而影响DNA甲基化。
首先，miRNA可以通过直接调节DNMTs的表达水平来影响DNA甲基化。
例如，miR-29a可以诱导DNMT3A和DNMT3B的降解，从而降低DNA甲基化水平。
而miR-148a和miR-152则通过直接结合DNMT1 mRNA并抑制其翻译来影响DNA 甲基化。
其次，miRNA还可以通过调节甲基化读取蛋白的表达来影响DNA甲基化。
比如，miR-34a能够抑制MeCP2的表达，从而减少其对DNA甲基化的识别和结合，降低DNA甲基化水平。
最后，miRNA还可以通过调节DNA去甲基化酶的表达和功能来影响DNA甲基化。
例如，miR-152和miR-185都能够通过直接结合TDG mRNA并抑制其翻译来影响其在去甲基化过程中的作用，从而影响DNA甲基化和去甲基化的平衡。
miRNA在DNA去甲基化中的作用DNA去甲基化对于维持基因表达的正常调控至关重要。
各种RNAs在基因表达调控中的重要作用
各种RNAs在基因表达调控中的重要作用RNA是一类非常重要的生物分子，包括mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、siRNA、lncRNA等多种类型。
在细胞内，RNA不仅仅是DNA的转录产物，还承担着多种生命活动过程中的核心角色。
尤其是在基因表达调控中，各种RNA起到了举足轻重的作用。
mRNA是细胞合成蛋白质的模板，是把DNA编码信息传递到蛋白质的关键步骤。
在转录过程中，RNA聚合酶将DNA模板转录成RNA，形成一段备选的mRNA序列。
在不同细胞类型、不同细胞状态、不同生理情况下，mRNA的合成和降解量都会有所变化，从而细胞可以在基因水平进行镶嵌的调节。
研究人员可以通过RNA测序技术，全面地了解不同条件下基因表达的差异，从而快速地鉴定和筛选出具有显著表达变化的基因。
tRNA则是转录成的非编码RNA，其主要功能是向正在合成的多肽链提供氨基酸，而tRNA还可以参与到转录过程中的表观修饰中。
同时在染色体拓扑结构调控中，tRNA也有着重要作用。
研究发现，大量tRNA分布于染色体表面的染色质处，这些tRNA有助于制约DNA的结构，调节蛋白复合体的聚合和染色体横向断裂，从而影响基因的表达。
rRNA是组成核糖体的RNA分子。
核糖体是细胞中负责蛋白质合成的重要酶，其由rRNA和蛋白组成。
rRNA在细胞内可以形成稳定的二级和三级结构，这些结构可以辅助其他RNA和蛋白的共同作用，从而完成针与mRNA的解码等关键步骤。
miRNA是一类长度约为22nt的小RNA，主要完成对mRNA的调控功能。
miRNA的生物合成复杂，需要经过成熟、切割等一系列过程，但几乎所有的细胞类型、不同细胞状态下的miRNA都已经被鉴定出来。
miRNA可以与mRNA互恋，通过直接靶向mRNA、间接调控转录因子等方式，调控基因表达。
miRNA参与细胞周期、细胞增殖、分化等基本生命过程的调控，也被广泛认为是肿瘤发生的重要因素。
siRNA与miRNA类似，同样也是一种小RNA。
miRNA——基因表达调节的多面手
miRNA——基因表达调节的多⾯⼿miRNA通常可以阻遏翻译、降解含有互补靶序列的信使RNA。
某些miRNA在细胞或组织中的特异表达，可能与细胞特性的形成与维持有关。
最近有研究表明，组织特异性miRNA可能在基因表达调节⽹络的多个层⾯上发挥作⽤。
如靶定百余个与当前分化状态不⼀致的效应基因，或是调控⽤于调节转录或选择性剪切的通⽤因⼦的表达⽔平。
在形态结构和⾏为习性的复杂性上差距甚远的各种⽣物体中，其负责编码蛋⽩质的基因数⽬差距却⾮常⼩，这不禁让⼈感到奇怪。
如果要为这⼀悖论提供可能的解释，那么也许就是因为基因表达调节⽹络精巧度的提⾼[1]可以对转录⽔平和mRNA 前体（pre-mRNA）的选择性剪切进⾏调节[2]。
最近，研究⼈员认为miRNA可能在⽣物体复杂性增⼤的过程中发挥了作⽤[3]。
某些miRNA的确在胚胎发育期间具有细胞或组织表达特异性，因⽽很可能在细胞分化过程中扮演重要⾓⾊[4]（O. Hobert 的⽂章中也提及这⼀问题[5]）。
个别组织特异性miRNA，如miR-1和miR-2，它们分别在肌⾁细胞和神经元中表达，已被证明能够激活相应细胞类型的分化[6~8]。
◆靶定基因群miRNA通过⼏种不同的分⼦机制发挥其⽣物学作⽤。
单个miRNA可以抑制某个特定发育阶段所需表达的⼀⼤类mRNA。
像这样⼀类被miRNA作⽤，功能相关且受控于基因表达⽹络的效应基因可以归为“基因群”（gene battery）。
在哺乳动物⾮神经元细胞中，导⼊miR-124就会⾸先减少多种⾮神经元mRNA的表达量，如编码细胞增殖或是神经⼲细胞作⽤所需蛋⽩的mRNA，导⼊miR-124后可以观察到它们数量的减少[7,9,12]。
相反，如果在初级神经元中除去miR-124就会导致⼤量⾮神经元靶标mRNA的累积[13]。
有报道称，miR1-9也以相似的模式发挥作⽤。
因此，在发⽣分化的细胞中，miRNA可以有效地除去祖细胞中留下的⾮必需mRNA。
[课件]miRNA$lncRNA(mirna 和lncrna 的简介)PPT
RNA22：基于序列特征预测microRNA的结合位点。是几个流行的 microRNA靶标预测软件的其中一个。IBM公司的研究团队开发的。 miRanda和：是著名的Memorial Sloan-Kettering 癌症研究中 心的研究人员开发的软件和数据库。整合实验室观察mirna表达模式和预 测mirna靶点。 MicroCosm：EMBL-EBI的Enright 实验室开发的microRNA靶标数据库。 miRTarBase：整合实验证实的microRNA靶标的数据库。
Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。 miRecords：一个整合的microRNA靶标数据库。整合多个靶标预测 软件的调控关系。 PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻 动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率也较低。是microRNA领 域大牛Rajewsky实验室开发的。该文章位列miRNA相关文章引用 Top5。 PITA：基于靶位点的可接性（target-site accessibility）和自由能预 测microRNA的靶标。是著名的生物信息学家Segal实验室开发的。 网址：
MiRNA 功能
• 只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。 • miR-273和lys-6编码的miRNA，参与线虫的 神经系统发育过程；miR-375调节哺乳动物 胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143在脂 肪细胞分化起作用。
• Karres, J. S., V. Hilgers, et al. (2007). "The Conserved microRNA MiR-8 Tunes Atrophin Levels to Prevent Neurodegeneration in Drosophila." Cell 131(1): 136-45. • 利用一种果蝇miRNA突变研究分析，认为 miRNAs将靶基因的水平调整到了最佳水平， 并由于这种小RNA的保守性，因此提出在人 类也存在这种关联。
调控基因表达的miRNA
评述第50卷第13期 2005年7月调控基因表达的miRNA陈芳①②殷勤伟①*(①中国科学院生物物理研究所, 系统生物学研究中心, 生物大分子国家重点实验室, 北京 100101; ②中国科学院研究生院,北京 100049. *联系人, E-mail: jqwyin@)摘要近年来, 在小分子RNA中发现了一类与调节基因表达密切相关的分子micro RNA (miRNA).miRNA由内源性基因编码, 可通过诱导mRNA的切割降解, 翻译抑制或者其他形式的调节机制抑制靶基因的表达. 寻找这类调节分子及其靶基因已成为研究的热点. 我们试图回顾miRNA的研究历史, 简介miRNA 分子的检测方法, 介绍 miRNA 在基因组中的位置、miRNA靶基因的搜寻、miRNA生物功能的鉴定, 并探讨miRNA的作用机制, 最后展望 miRNA 在调控生命体的发生、生长、发育和分化等方面的重要作用. 可以预测, 全部miRNA基因功能的鉴定必将给人们对生命体的研究带来新的理念、方法和思路.关键词miRNA RNA干扰生物信息学基因调控micro RNAs (miRNAs) 是一类长约22核苷酸的非编码的单链RNA分子, 它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中[1]. 最早发现的是lin-4和它的靶mRNA, 即lin-14[2]. 1993年, Lee等人[2]用经典的定位克隆的方法在线虫(C. elegans)中克隆了lin-4基因, 并通过定点突变发现lin-4并不编码蛋白, 而是产生一种小RNA分子. 这种小RNA分子能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3′非翻译端的特定区域相互作用来抑制lin-14的表达, 最终导致lin-14蛋白质合成的减少, 这种现象叫做转译抑制. 通过转译抑制, lin-4控制着C. elegans幼虫由L1期向L2期的转化. 为什么一个只有22 nt的RNA分子起着如此重要的调节作用? 当时人们无法解释, 只能认为是一种稀少的个别现象. 但是, 2000年第2个miRNA let-7 [3]及其人类和果蝇中同源物的发现改变了人们的看法, miRNA可能是一类进化上保守的、在生命中起着重要调控作用的分子. 它们能有效地抑制相关蛋白质的合成,导致靶mRNA的降解, 或者其他形式的调节机制来抑制靶基因的表达, 产生基因沉默[4,5]. 近年来发现miRNA 可能在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用, miRNA 序列、结构、丰度和表达方式的多样性,使其可能作为蛋白质编码mRNA 的强有力的调节子. miRNA 的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识, 补充了在RNA水平对靶mRNA分子进行更迅速和有效的调节, 展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统[6]. miRNA 的发现也是对中心法则中RNA次要的中介角色的重要补充, 它将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其发育等方面的重要问题.1 miRNA的产生迄今为止, 在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中已发现了一千多个miRNA基因(表1). 这些miRNA基因首先在细胞核内转录成前体转录本(pri-miRNA), 并被加工成前体pre-miRNA, 然后被转运到细胞质被加工成成熟的miRNA(图1). Lee等人[7]第一次证明一大类miRNA由多聚酶Ⅱ(PolⅡ)转录, 而且一些miRNA的转录本(如let-7)具有5′帽和3′ poly(A)的结构, PolⅡ的抑制剂能够抑制pri-miRNA的积累, 而PolⅡ能与miRNA的启动子免疫共沉淀. Rodriguez等人[8]在基因组水平对miRNA的转录也进行了分析, 哺乳动物中由内含子编码的miRNA, 其转录酶应该是PolⅡ, Rodriguez等人[8]检测的miRNA与90个蛋白编码基因有关. 但是并不能排除miRNA还有其他多聚酶, 寻找与miRNA相关的其他聚合酶还有待进一步的研究. Pri-miRNA在核内被RNaseⅢ核酸酶Drosha加工成长约70 nt的发夹状的pre-miRNA[9]. 最近的报道指出[10,11], Drosha和另外的一些成分(如人类中的DGCR8蛋白、果蝇中的Pasha蛋白)构成一个微小RNA处理器(microprocessor)的复合体, pri- miRNA在这个microprocessor中被加工成pre-miRNA. 关于在pri-miRNA之前miRNA基因的转录本是如何加工的, 人们所知甚少. 线虫miRNA基因let-7前体是一个相对较长, 且具有poly(A)结构, Bracht等人[12]第50卷 第13期 2005年7月评 述图1 miRNA 基因的发生和作用机制表1 最新的已确认miRNA 数量(来自Rfam, 经实验数据证明)[56]物种数量 物种数量 黑腹果蝇(D . melanogaster ) 78 非洲爪蟾(X . laevis )7 拟暗果蝇(D . pseudoobscura ) 73 斑马 (D . rerio ) 33 冈比亚按蚊(A . gambiae ) 38 拟南芥(A . thaliana ) 114 意蜂(A . mellifera ) 25 栽培稻(O . sativa ) 173 秀丽隐杆线虫(C . elegans ) 116 两色蜀黍(S . bicolor ) 64 桅杆线虫(C . briggsae ) 79 玉蜀黍(Z . mays )40 茶花鸡(G . gallus ) 122 EB 病毒(Epstein Barr virus) 5 人(H . sapiens ) 227 卡波西肉瘤相关疱疹病毒11 小鼠(M . musculus ) 230 (Kaposi sarcoma-associated herpesvirus )大鼠(R . norvegicus ) 191 人巨细胞病毒(H . cytomegalovirus ) 9 狗(C . familiaris )6鼠 γ 疱疹病毒68 (M . gammaherpesvirus 68)9发现let-7转录本经历一个反式剪辑(trans-splicing)的过程, 生成一个叫做SL1RNA(spliced leader1)的中间体. pre-miRNA 在Exportin5的帮助下从核进入胞质内[13~15], 这个过程还需要一个G 蛋白因子Ran 参与[13]. 能与exportin5结合的pre-miRNA 必须具有大于16 nt 配对的茎和3′末端有2个悬垂碱基的结构特点, 末端如果是5′悬垂碱基将会抑制exportin5对它的转运[15]. 胞质中pre-miRNA 在Dicer 酶的作用下, 被切割成双链的miRNA ∶miRNA *配对分子, 然后成熟的miRNA 分子被解链, 单链的miRNA 进入一个核糖蛋白复合体miRNP(也叫RISC), miRNA 通过与靶基因的3′UTR 区互补配对, 指导miRNP 复合体对靶基因mRNA 进行切割或者翻译抑制[16~18].2 寻找miRNA 基因2.1 克隆方法寻找miRNA 基因2001年miRNA 研究开始飞速发展. Lagos- Quintana 等人[19]设计出一种专门克隆小片段RNA 的方法(图1(a)), 在2 h 的果蝇胚胎的裂解液里和Hela 细胞的总RNA 中克隆了37个新的miRNA 基因. Lau评述第50卷第13期 2005年7月等人[20]用稍微改进的克隆方法在线虫中找到了55个miRNA基因. Lee等人[21]运用生物信息学和cDNA文库相结合的方法找到了13个miRNA. 随后掀起了寻找miRNA基因的热潮. Lagos-Quintana等人[20,23]继续他们寻找miRNA基因的工作, 2002年和2003年用同样的方法分别在小鼠和人特异组织中克隆了34和31个新的miRNA, 并提出由于在克隆中已知的miRNA 重复出现和rRNA的干扰, 用同样的克隆方法找到新的miRNA会越来越难, 这与后来Lim等人[24,25]用MiRscan计算机程序估计人类中只剩下40个未知miRNA基因的结论一致. 近来, 寻找miRNA的方法越来越成熟, Ambros等人[26]对克隆寻找miRNA的方法进行了总结.继而, 人们将寻找miRNA基因的目光转向特异的组织和发育的特异阶段[27~31]. Mourelatos等人[32]用小片段克隆的方法在HeLa细胞中克隆了31个miRNA, Houbavity等人[29]在小鼠ES细胞中克隆了15个miRNA, Dostie等人[28]和 Kim等人[30]在哺乳动物神经细胞中分别找到了53和40个miRNA, Ambros 等人[33]在线虫中又找到21个miRNA, Aravin等人[27]在果蝇的不同发育阶段找到了63个miRNA, Wang等人[34]人在籼稻中找到了20个miRNA基因. Pfeffer等人[35]在EB病毒的基因组中, 找到5个编码miRNA 的基因, 这为miRNA基因家族添加了病毒中的成员. 最近研究人员又在另3种病毒中找到了29个病毒miRNA[36]. Suh等人[37]在人胚胎干细胞中找到了36个miRNA基因, 这些miRNA随着胚胎的发育表达量逐渐减少. Seitz等人[38]在人的14q32区域找到46个miRNA基因, 发现它们多数在人的胚胎中表达, 只由母性染色体表达, 并且受到上游200 kb处的一个甲基化区域(IG-DMR)调节. Kasashima等人[39]运用克隆的方法检测了TPA诱导人白血病细胞HL-60分化前后miRNA表达谱的变化, 找到了3个新的miRNA, 并发现不同miRNA在分化前后表达量不同. 现在科学家们已在不同的种属中克隆了大量的新miRNA基因.2.2 检测miRNA表达的方法检测miRNA最常用和直接的方法是Northern杂交, 除此之外, 还有RT-PCR, 液相杂交和基因芯片技术等. Lee等人[7]通过Drosha-siRNA下调Drosha, 抑制pri-miRNA的加工, 再用RT-PCR的方法检测miRNA的表达. Sempere等人[40]通过Northern 杂交的方法对已知的119个miRNA基因的表达做了检测, 发现有一些是在特异的组织表达, 有一些只是在不同组织的表达量不一样, 而在脑组织表达的miRNA 的作用方式表明这些miRNA与脑神经元的分化相关. Allawi等人[41]将荧光方法引入miRNA的研究中, 设计出一种新的方法叫“Modified Invader”分析, 可快速而灵敏地分析miRNA, 能从50~100 ng总RNA或者是1000个细胞的裂解液中检测到目的miRNA.miRNA基因芯片技术是一种更理想的快速有效的检测miRNA表达图谱的方法. 这一方法被Liu等人[42]首次报道用来检测miRNA在不同肿瘤细胞中的表达图谱, 245个哺乳动物的miRNA被检测了, 结果的重复性很好, 而且被Northern杂交、RT-PCR所证实. 之后, Esau等人[43]运用miRNA芯片技术, 检测细胞内的miRNA表达图谱, 并且找到了miR-143和它的靶基因. Calin等人[44]通过miRNA芯片技术, 比较了哺乳动物中B细胞淋巴瘤和正常细胞中miRNA的表达图谱, 为miRNA在肿瘤临床应用中, 提出了新的思路. Miska等人[45]运用miRNA芯片检测了小鼠脑发育中138个miRNA基因的表达图谱. 在芯片的基础上, Nelson等人[46]发展出一种叫做RAKE (RNA-primed, array-based Klenow enzyme assay)的方法能够在特定的细胞和肿瘤中同时检测所有的miRNA的表达图谱.原位杂交技术[47,48]用来检测miRNA, 更直观的展示出miRNA的表达方式, 是了解miRNA的时空表达谱更方便的方法. Johnson等人[49]通过在let-7启动子后加GFP基因来跟踪检测线虫中let-7的时空表达. Mansfield等人[50]根据miRNA的作用机制设计出一种带Laz报告基因的检测方法, 被叫做“miRNA sen-sor”, 能特异的从原位检测到miRNA的表达.2.3 计算机软件预测miRNA基因miRNA是由一个约70 nt的茎环结构前体而来, 并且在进化上是保守的, 因此可用计算机的方法来识别.MiRscan[24,25]是一个能特异的识别2个物种间的同源序列的程序. Lim等人[25]用它在C. elegans和C. briggsae中寻找到同源的发卡结构, 通过已知miRNA的训练后, 它去给那些发卡结构片段打分, 以预测线虫中的miRNA. Lim等人[24]用同样的方法, 在脊椎动物里寻找miRNA基因, 并预测出人的miRNA基因数在200~255之间, 这个数字大约是人类基因组的1%. 2004年, MiRscan程序又被用来检测第50卷第13期 2005年7月评述了线虫中miRNA基因上下游序列的同源性[51], 和内含子中产生miRNA的寄主基因的同源性(host gene), 并且找到了一个非常一致的序列模块, 运用这个不断改进的MiRscan, 又在线虫中发现了9个miRNA, 并被PCR实验所证实[51].MiRseeker[52]是根据miRNA的3个特点开发出来的: (ⅰ) miRNA的保守性, 需要形成一个70~100 nt 的前体; (ⅱ) 在相似的物种中, miRNA是很保守的; (ⅲ) 在相距较远的物种间, miRNA是有一定的分歧的. 它包括以下3个步骤: (ⅰ) 通过AVID寻找果蝇中基因间的保守的序列; (ⅱ) 通过mfold辨认此序列是否能形成保守的茎环结构, 并给这个结构打分评价; (ⅲ) 评价miRNA在不同物种中的分歧模式. 最后, miRseeker也需要通过生物化学的方法, 加以验证.Legendre等人[53]用“ERPIN”代替“blast”从基因组中搜寻与已知miRNA类似的miRNA基因, 输入已知miRNA软件可以根据已知miRNA的结构从基因组中搜寻到结构类似的候选miRNA基因.除了专门用于寻找miRNA基因的程序和软件外, 象mfold和Srnaloop是RNA折叠中常用的软件. Hofacher等人[54]报道在维也纳RNA网站(http: //rna.tbi.univie.ac.at/)提供了一个界面能够调用多个常用的RNA二级结构预测软件.2.4 miRNA的命名及Rfam数据库miRNA种类越来越多, 而且在研究中发现, 很多miRNA是同源的, 为了防止miRNA的混淆, 最初的研究者就给发现的miRNA作了命名规则[19]: (ⅰ) miRNA简写成miR-No., 它的基因简写成mir-No.;(ⅱ) 高度同源的miRNA在No.其后加英文字母(小写, 一般从a开始);(ⅲ) 多基因拷贝的再在后面加-No. (如miR-2a-1).之后人们又对命名规则作了补充[55,56]. 不同物种中同源的miRNA最好用同一个名字; 如果一个前体的2个臂分别产生1个miRNA, 则根据克隆实验, 看看哪个是主要的成熟产物, 次要的在后面加“*”号, 如miR-56和miR-56*(*表示量少的); 如果不能区分表达量的多少, 可以如下表达, 如: miR-142-5p(表示在5′端的臂, 以前有人用miR-142-s)和miR-142-3p (表示3′端的臂, 以前有人用miR-142-as). 在Rfam数据库中, 在每个miRNA名称前加上了物种的名称, 如: hsa-miR-138. 植物中miRNA的基因用斜体表示, 如MIR156.为了更好地管理miRNA, 方便人们查询, 研究者们建立了miRNA的数据库http: /// Software/Rfam/mirna/. 现在这个数据库已经更新到了6.0版本(2005年4月), 共有1650个miRNA(表1). Rfam只有在文章发表后才给新发现的miRNA一个确定的名字, 在发表前作者可以用一个临时的名字命名送审.3 miRNA的靶基因虽然现在已经找到了过千个miRNA, 并提出它们在细胞增殖、分化、代谢与死亡中发挥着重要的调节作用, 但是至今为止, 真正确认功能的miRNA还是微乎其微[1,57,58]. 从1993年发现第1个miRNA到现在, 在动物中发现的确认功能的miRNA不超过10个[59~67](表2).3.1 基因筛选和定位克隆寻找miRNA靶基因通观科学家们寻找miRNA及其靶基因的方法发现, 现在已知靶基因的miRNA多是通过传统的基因表2 已知功能的miRNA基因miRNA 物种靶基因生物学作用文献Lin-4 线虫Lin-14和lin-28时序发育[2] Let-7 线虫 Lin-41和hbl-1 时序发育[3] lsy-6线虫Cog-1转录因子调节化学感受器的左右不对称性[61] miR-273 线虫die-1转录因子调节化学感受器的左右不对称性[64] Bantam 果蝇 Hid前凋亡基因发育中调节细胞增殖与凋亡[59, 60] miR-14 果蝇未知凋亡和脂类代谢[63] miR-181 哺乳动物未知造血系统的分化[62] miR-196 哺乳动物HOXB8脊椎动物发育[50, 65] miR-143 哺乳动物ERK5脂肪细胞的分化[43] miR-375 哺乳动物Mtpn胰岛素分泌的调节[66] miR-430 斑马鱼待定脑的形态发生[67]评述第50卷第13期 2005年7月筛选(gene screen)和定位克隆的方法发现的[2,3,59~61] (图2). Brennecke等人[59,60]发现bantam基因及其靶基因hid, 包括典型的如下几个过程: (ⅰ) Bantam基因表达miRNA的证据: (1) 通过插入突变, 找到bantam 这个位点, 能够促进组织过度生长; (2) bantam缺陷的个体, 具有生长缺陷或者是蛹化期致死; (3) 在2个物种间比对(在Drosophila与Anopheles用Clustal W程序比对), 发现一个约90 nt的区域非常相似, 有30/31 nt是相同的, 再用mfold进行预测发现2个物种内的这段区域能形成相似的稳定的发卡结构; (4) 用这31nt作探针, 通过Northern 杂交在野生和Gal4诱导表达的L3期中找到这个21 nt RNA和它的更大的前体. (ⅱ) 证明hid是bantam的靶基因的过程: (1) 用计算机预测的方法找到前凋亡基因hid的3′ UTR 区, 有3个能与bantam作用的靶点, 而且直接观察发现还有2个靶点; (2) 对比这些3′ UTR区在2个物种的同源性(D. pseudoobscura与D. melanogaster), 发现它们高度同源; (3) 表达报告基因tubulin-EGFP, 在它的末尾连上hid的3′ UTR区的靶点, 同时转入EP 表达的bantam, 发现GFP荧光明显下降, 而且5个靶点同时存在的效果要比单个的好; (4) 同时表达bantam和hid, 通过原位杂交, 能检测内源表达的hid 也能被bantam抑制. 根据一个miRNA可能调节多个靶基因的观点[1], 发现bantam能够促进细胞的增殖, 很可能bantam还具有一个细胞增殖负调控的靶基因.Chen等人[62]的方法略有不同. 他们先用miRNA 的cDNA克隆的方法在小鼠骨髓中克隆了100多个miRNA, 并且特别的研究了其中3个的功能. 结果发现在造血干细胞中异位表达miR-181能够促进造血干细胞的定向分化, 但是没有找到它的靶基因. Xu等人[63]通过P插入元件找到突变子, 发现具有死亡抑制的功能, 并证明编码miR-14. 通过功能缺失和异位表达的方法, 证明miR-14有着抑制reaper导致的细胞死亡和参与脂肪代谢的功能. 实验提出miR-14可能的靶点是Drice, 但没有直接的证据证明.3.2 计算机程序对靶基因的预测从已有的资料看来, 传统的方法寻找miRNA的靶基因比较艰难, 由于目标不明确, 效率较低. 研究人员想到用生物信息学的方法来取代大量的分子克隆的工作, 并且获得很好的目的性.图2 cDNA克隆与生物信息学相结合的方法寻找miRNA基因方形框为分子生物学方法, 椭圆形框为生物信息学方法; 每条路线都可以确定一个miRNA第50卷 第13期 2005年7月评 述图3 miRNA 功能解析方形框为分子生物学方法, 椭圆形框为生物信息学方法Stark 等人[68]的方法是首先构建一个在D. melano - gaster 和D. pseadoobscura 中保守的3′ UTR 数据库, 能覆盖D. melanogaster 三分之二的基因. 用HMMer 比对程序, 找到能与miRNA 前8个碱基配对的3′ UTR 靶序列; 然后再用mfold 对整个miRNA ∶mRNA 靶序列进行动力学检测, 并给出∆G 值; 最后计算Z 值, 取Z ≥3作为筛选靶序列的阈值. 通过这一程序成功的在数据库里找到5个已知的miRNA 和它们的靶基因, 同时预测出3个新的miRNA 和它们的靶基因: miR-7和Notch , miR-2和前凋亡基因、miR-277和代谢酶类(但随后的生物学实验证据并不强). 结果可在http://www.russell.embl.de/miRNAs 查询.Enright 等人[69]开发出一种计算机预测的方法: 先从 D. melanogaster 和 D. pseadoobscura 中通过blastn 和AVID 比对构建出3′ UTR 序列库; 然后用MiRanda 算法评价, MiRanda 是一个类似于Smith-Whatman 的算法, 但它是用来检测互补配对的(其中允许G ∶U 配对), 此外这一算法还加入了RNA 二级结构预测的程序(来源于RNAlib), 能够从动力学角度预测miRNA ∶靶mRNA 的稳定性; 再将前面的结果在3种生物中检验保守性(D. melanogaster , D. pseudoobscura 和A. gambiae ), 最后给出S 值和∆G 值. 这个方法考虑了以下几个特点: (ⅰ) 局部位置的互补比对; (ⅱ) RNA-RNA 双链自由能的预测; (ⅲ) 靶位点的保守性. 结果显示, 靶基因多是发育阶段特异表达的、与细胞分化、形态、发育协调相关的基因, 而且有很多是转录因子. 其中, 作者提出3′ UTR 调节很类似于转录中的5′ promoter 的调节, 这说明在这2个机制之间可能有一定的联系. 结果可在http:// 查询.Lewis 等人[70]开发了一个计算机预测的方法 —— TargetScan 法, 用来预测哺乳动物内miRNA 的靶基因. 这一方法基于2点考虑: (ⅰ) 考虑miRNA ∶mRNA(靶向基因mRNA 片段)双链结构的稳定性; (ⅱ) 检测这些靶向基因mRNA 的3′ UTR 区在不同物种间的保守性. 此搜索方法重点强调了miRNA 的第2~8个碱基, 将这段序列作为搜索的“种子序列”, 必须严格配对; 然后用RNAfold 程序向两边延展寻找配对的序列; 通过RNAeval 给出自由能G 值; 最后给出Z评述第50卷第13期 2005年7月值和R值, Z值越大, R值越小, 靶向的可能性就越大. 通过对在人、小鼠、大鼠中保守的miRNA的搜索, 找到了451个可能的miRNA靶向序列; 通过对人、小鼠、大鼠、河豚4种动物中保守的miRNA搜索, 找到了115个可能的靶向序列. 结果可在网上查询http:// /targetscan.Kiriakidou等人[71]开发一个“DIANA-microT”的程序, 通过计算机的方法来预测哺乳动物中miRNA 的靶基因. Rehmsmeier等人[72]开发了一个“RNA-hybrid”的程序, 来预测果蝇的miRNA的靶基因, 他们的信息公布在互联网上(http://bibiserv. tech-fak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/). PicTar是由Krek等人[73]开发的预测miRNA靶基因的软件, 他们搜索了8个脊椎动物物种的基因组和现有的miRNA, 它对靶基因预测具有较高的准确性.John等人[74]运用miRanda软件预测了218个哺乳动物的miRNA基因的靶基因, 发现有2000个的哺乳动物的基因有着保守的3′ UTR靶点, 这些蛋白多数涉及转录因子、miRNA机制本身相关的蛋白、泛素机制相关的蛋白, 这些可能的靶蛋白说明miRNA 的作用构建了一个反馈调控网络, 并且根据他们的预测, 占基因组数量1%的miRNA基因可能调控着10%的基因组蛋白. 预测软件在互联网上(http:// ).综合人们用计算机的方法预测miRNA的工作, 发现各种计算方法都具有如下的特点: (ⅰ) miRNA 及其靶向序列的保守性; (ⅱ) miRNA∶靶mRNA配对中5′端非常重要, 其他位置允许G∶U配对; (ⅲ) miRNA与靶向基因可能是一对多的关系. 通过计算机预测出的miRNA靶基因, 如表3所示.4 miRNA的作用机制及功能4.1 miRNA的作用机制miRNA转录前体(Pri-miRNA)首先在核内被RnaseⅢ核酸酶 Drosha加工成约70个核苷酸长的发夹状的RNA, 在Exportin5的帮助下从核内进入胞质内, 然后在Dicer酶的作用下, 单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP, David[1]将其与RISC等同. miRNA通过与靶基因的3′ UTR区互补配对, 指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制[18~20]. MiRNA到底是抑制还是切割取决于miRNA 与靶序列互补配对的程度, 互补配对高的可能进行切割, 而配对低的就只是抑制. 植物的miRNA与靶基因配对程度高多数是进行切割, 而动物中miRNA 与靶序列的配对性不好, 多数进行翻译抑制.线虫中, lin-4 RNA并不降低lin-14和lin-28的mRNA水平, 但能降低它们的蛋白水平[2]. Let-7也通过与lin-41的3′ UTR区配对, 来抑制mRNA的表达, 并不进行切割[3]. 现在普遍认为, 细胞中的miRNA 能与靶基因mRNA的3′ UTR部分配对, 指导miRNP 对其翻译的抑制. 这与现在所知的真核基因的翻译调控主要是在3′ UTR区域的思想一致[75], 最近Xie等人[76]在人、小鼠、大鼠和狗的基因组比对分析指出, 在3′ UTR区域存在大量的调节结构域, 而近一半的这些调节结构域与miRNA的调节有关. 其中miRNA的5′端的2~8个核苷酸对于miRNA与3′ UTR表3 预测的miRNA及其可能的靶基因miRNA 物种靶基因生物学功能文献miR-7果蝇HLHm3, hairy类的HLH转录因子, m4 Brd家族 Notch介导的神经分化[68] miR-14果蝇grim, reaper, sickle促凋亡[68] MiR-1人类BDNF生长因子神经发育[70]G6PD抗氧化性MiR-19a人类PTEN 肿瘤抑制基因[70] MiR-23a人类SDF-1造血前体细胞的生长和定位[70]BRN-3b POU-domain转录因子神经发育MiR-26a人类SMAD-1TGF-β通路[70] MiR-34人类Delta-1跨膜蛋白激活Notch [70]Delta的Notch 1跨膜受体在分化中决定细胞的命运MiR-101人类ENX-1 polycomb基因造血细胞的增殖[70]N-MYC类的HLH转录因子前癌基因, 细胞的分化和增殖MiR-130人类MCSF 单核吞噬细胞的调节[70]第50卷第13期 2005年7月评述的配对非常重要. 首先, miRNA的2~8个核苷酸能很好的与靶序列配对[77]; 其次, 靶序列在不同物种中通常保守[68]; 再次, miRNA的2~8碱基在同源的miRNA中保守[70]. 因此, 人们用此来预测miRNA的靶基因. miRNA抑制mRNA的翻译机制至今为止是个迷[1]. David[1]提出2种可能性: (ⅰ) 在mRNA起始翻译后, miRNA通过与3′ UTR作用抑制翻译的进行, 这样可能可以通过检测mRNA上的核糖体的密度而加以证实; (ⅱ) mRNA的翻译并不被阻止, 但是翻译的多肽不断的被miRNP复合体, 或者再结合别的蛋白复合体切割, 当然这需要肽酶参与. 这些机制的研究可以和siRNA的作用相结合起来, 近来关于Argonaute蛋白PAZ结构域晶体结构的测定揭示了RISC与RNA结合的作用机制[78~80]. 当然miRNA抑制机制的揭示有待于miRNA领域的深入研究.4.2 miRNA的功能miRNA是一种广泛存在的对基因表达进行微调的分子. 在人类基因组中miRNA基因占据大约1%的数量, 虽然在不同的时空发育阶段, 它们的表达量不同, 但是多种miRNA在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的miRNA环境中, 这个环境控制着成千上万的编码基因的mRNA水平, 使得各种蛋白的表达处在一个适合的水平. Bartel等人[57]将这些miRNA 比作微型电阻, 根据miRNA与靶基因互补的程度, 执行从切割(100%抑制)到微弱抑制的不同的抑制作用. 象lin-4作用于lin14和lin28; let-7作用于lin41和hbl-1, 起着明显的表型改变, 是在miRNA家族中为数较少的, 更多的则是起着微调的作用. 像miR-7和miR-14有着多个靶基因, 它们从一个整体上起着介导某一功能的作用. 由于有多个靶点, 有些miRNA 会有大量的表达, 比如miR-2在一个细胞内有约50000个拷贝, 这远多于普通mRNA的表达量. 通过芯片技术Lee等人[81]研究了通过导入某些miRNA能够导致上百个基因mRNA水平的下调, 虽然并不能完全肯定所有的这些下调基因是由miRNA直接导致, 但这给出了直接证据证明一个miRNA可以调控多个靶基因. 另一些则是多个miRNA作用于一个靶基因上, 而最近开发的同时检测所有miRNA的表达图谱的技术[46], 使研究者能更方便地从整体上掌握特定的时空阶段miRNA产生的生物学效应. miRNA这种转录后微调的优点有如下几点:(ⅰ) 比从蛋白水平的调节更节省能量;(ⅱ) 相对于转录调节, miRNA的效果更快而且是可逆的;(ⅲ) 对于一些只需微量蛋白改变的现象, 只有通过miRNA来达到. 比如对某种蛋白来说, 1~2个mRNA拷贝就足以过量表达, 这时就需要miRNA来调节控制蛋白的水平;(ⅳ) 内含子中编码的miRNA是一种细胞内资源的高效利用.就像前面提到的一样, miRNA主要通过抑制它的靶基因来起调控作用, 至今为止没有发现有上调能力的miRNA. 从表2和表3可以看出, miRNA的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程. Lewis等人[70]的预测结果发现, 预测的miRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因. 虽然miRNA的作用也是特异的, 特别是5′端的2~8个碱基, 特异性的靶向与它的靶基因, 但是与siRNA不同的是miRNA的特异性并不是那么强, 在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶基因, 如lin-4作用于lin14和lin28[2], let-7作用于lin41和Hbl-1[3](表2), 这就是人们提出的“多个靶点”的假说. 人们也提出可能多个miRNA调控一个靶基因[3,82]. 因此, miRNA的调控作用很可能是一种调控网络, 它需要接受某些信号的刺激, 从整体上调控有机体的生命活动.miRNA的研究现在还处在理论水平上, 讨论关于miRNA的应用还为时过早, 但miRNA作为体内正常表达的基因, 是否与人类疾病[83]和植物培育相关, 还有待进一步的研究. 以miRNA为靶点或者以miRNA为治疗手段的设想[83], 以后可能会成为焦点. 而Calin等人[44]报道的miRNA基因芯片技术也很可能成为肿瘤诊断的工具. Suh等人[37]报道, 在人胚胎干细胞中表达的miRNA与其他细胞类型的miRNA有很大的不同, miRNA作为人器官定向分化的调节子, 为以后人器官体外培植带来促进作用. miRNA作用和功能的揭示必定给miRNA的应用带来广阔前景.5 展望自从在四膜虫中发现核酶以来, 引起了整个生物学界对RNA及其作用的关注, 也让人们就生命起源的问题争论了十几年. 在人们对生命由RNA起源的争论降温的时候, 1998年, Fire等人报道在线虫中发现了RNAi的现象, 重新又将人们的视线转到RNA 上来. RNAi是一个强大而特异的基因沉默机制, 可成为研究基因功能[84]和疾病治疗[85]的有用工具, 这。
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第二种方法: 由生物信息学预测miRNA的靶基因.预测miRNA靶 基因的网站:
/mammalian/index.html.
/ /microrna/home.do /
1.miRNA与细胞增殖
2.miRNA与细胞凋亡
Stress(H2O2,UV等)
3.miRNA与细胞信号传导
Proinflammatory cytokine
转录因子p53
转录因子NF-kB
miR-34a
miR-146
apoptosis
(1) IL-1 receptor- associated kinase 1 (2) TNF receptor- associated factor 6
ห้องสมุดไป่ตู้
八. miRNA表达调控与肿瘤
1. miRNA在基因组DNA上拷贝数的改变(扩增,转位和缺失) 比如: (1) 在B-CLL中, miR-15a/16-1族区域DNA出现缺失. (2) 在淋巴瘤细胞中, miR-17-92族区域DNA出现扩增. 在胶质细胞瘤中, miR-26a出现扩增 (3) 在T-ALL中, miR-17-92出现转位.
为进一步证实miRNA确实调节该靶基因,还需完成以 下实验
1,突变3’UTR 上与 miRNA结合序列(主 要是种子序列),观察 突变后的3’UTR 可否 废除miRNA对 luciferase活性的影 响
2,观察过表达或 抑制miRNA后,内 源性靶基因 mRNA和蛋白质 水平是否相应改 变.
3,miRNA与靶基因 功能相关性的研究
抑制cytokine signaling
四.microRNA表达的特点
1,时间特异性 在高等生物,microRNA的表达在生长发育的不同阶段是不同 的..
2,组织特异性 在不同的组织中, microRNA的表达不同的
四.寻找 miRNA 基因
1. Forward genetics
2. MiRNA cloning
Micro RNA在基因表达调控中的作用
一.怎样定义miRNA(成熟)
1, 长度为22nt的转录体.可通过northern blot等方法检测得 到. 2,其前体为典型的发卡结构.miRNA位于发卡结构的茎部分. .
3, 通过Dicer酶的处理后生成.
4,序列具有高度的保守性.
二.miRNA的生成过程
注意事项: 1.并非所有的差异表达基因都是miRNA的靶基因.许多差异基因表达 的改变是由靶基因表达的改变而引起.
miRNA P53的靶基因不是该miRNA的靶基因
转录因子p53
P53的靶基因
2.该方法不能证实miRNA所有的靶基因.根据miRNA与靶基因mRNA 3’UTR的配对程度不同, miRNA可降解靶基因mRNA(配对程度高),也可不 降解靶基因mRNA (配对程度低) 但抑制mRNA的翻译,
putational approaches to miRNA discovery
五.检测 miRNA 表达的方法 1, Northern 杂交 2, Real-time RT-PCR
3. 基因芯片的方法
六．怎样预测miRNA的靶基因 第一种方法: 过表达或抑制miRNA的表达,利用基因芯片筛选出差异表达基因.从 这些差异表达的基因中,证实miRNA的靶基因.
注意事项: 根据背景知识, 选择两个或两个以上网站均有预测的靶 基因做进一步分析
七．怎样证实miRNA的靶基因
5’UTR
靶基因mRNA
ORF
3’UTR
AAAAAAAAA PCR扩增3’UTR
克隆3’UTR到报告基因 luciferase下游 luciferase 3’UTR
报告载体
将重组载体转染细胞,观察过表达或抑制miRNA 后,luciferase活性是否改变.
2. miRNA合成的影响
3. miRNA的转录调控 (1)转录因子对miRNA的调节作用.
(2)DNA甲基化对miRNA的调节作用.
比如: miR-136,-431,-432,-433. (3)表观遗传对miRNA的调节作用.
4.miRNA与肿瘤的转移 比如: miR-10b,miR-9,miR-31 and miR-335与乳腺癌的转移有关
注意事项: 1,通过RNA聚合酶II转录生成.具有mRNA的结构特征 2,可以是多顺反子结构.即一条pri-miRNA包含多个成熟 miRNA的信息.
3,在判断一非编码蛋白质的mRNA是否生成miRNA时,我们可 以通过抑制Drosha的活性,观察pri-miRNA的含量是否增加. 4,miRNA可来源于外显子,也可来源于内含子和非编码序列.
5.miRNA在基因组DNA上成族分布,处于同一族的miRNA常共 表达
6. 对于同一家族miRNA,其功能常具有互补作用. 比如: 在MYC诱导的B细胞淋巴瘤小鼠模型中,剔除miR-17-92 族DNA序列可诱导凋亡,如果导入此族中的任意一种miRNA均 可减轻细胞凋亡. 7. 不同miRNA可同时调节同一靶mRNA 三. miRNA 的作用机制及功能 作用机制:与靶基因mRNA 3-非翻译区通过不完全配对结合降低mRNA稳 定性或抑制靶基因的 翻译.此外, miRNA也可与5-非翻译区和编码区序列 结合调节靶基因的表达. 有文献报道,miRNA可与mRNA3-非翻译区的其他 部位结合,升高mRNA的稳定性. 注意事项: 1, 由于miRNA与靶序列是通过不完全配对结合,因此证实 miRNA的靶基因成为一难点. 2,一种miRNA常有多个靶基因. 功能: miRNA 主要通过抑制它的靶基因来起调控作用。miRNA 的作用 遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程。 Lewis 等人的预 测结果发现，预测的 miRNA 的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿 瘤发生的基因。虽然 miRNA 的作用也是特异的，特别是5'端的2～8个 碱基，特异性的靶向与它的靶基因，但是与 siRNA 不同的 是 miRNA 的特异性并不是那么强，在生物体内往往一个 miRNA 作用 于多个靶基因