比较蛋白质组学在肝癌研究中的进展

Ｓ１００ＡＩ
ＮＬ胶条分析，蛋皇质以禽４００一６００讳ｇ
的上样量，电泳效果最好（镊染）。 ３比较蛋臼质组学在肝细胞癌（ＨＣＣ）研究中的应用
３．１
ｊｌ手癌纲脆系近年来多静翳癌细胞系已广泛尾予蛋盘
组学研究。Ｙｕ等¨到用２一ＤＥ对人类肝癌细胞株ｂｃｌ－７４０４和 援常人类肝细胞株Ｌ－０２爨自质组进行研究，发现ＢＥＬ－７４０４ 牵ＧＳＴＰｌ—１、ＨＳＰ２７、内驻隧钙结合鬣鑫等表达上调，ＮＫ缨臌 增强子Ｂ和Ｂ—ｌ微管蛋囟下调。丝氨酸蛋白酶抑制物在正 常肝细胞中裘达明显增高，而脂肪酸结合蛋白仅在正常肝绷 胞孛捡溺楚。露２－ＤＥ翻ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ对人类翳癌纲蕤 系ＨＣＣ—Ｍ进行蛋白质组分析，并与ＳＷＩＳＳ—ＰＲＯＴ和ＮＣＢＩ的 数据库相匹配，共检测到约４００个蟹白质，除犬部分的正常 脬酶外，还鸯一些特异爱鑫，如１４暴。蛋自、钙结合蛋骞、挽 增蛋白及硫氧蛋白过氧化物酶等与癌变有关。Ｃｕｉ等Ｈ列应 用２一ＤＥ结合ＬＣ－ＥＳＩ—ＭＳ—ＭＳ技术，比较无转移的肝癌细胞 Ｈｅｐ３Ｂ与其蠢转移潜熊懿ＭＨＣＣ９７Ｈ、ＭＨＣＣ９７Ｌ蛋叁覆表达 谱的差异。分析了５０个差异蛋自点，其中２６个被鉴定，包 括钙依赖磷脂结合蛋白Ｉ和Ｓ１００钙结合蛋白Ａ４（Ｓ１００Ａ４） 等，与菲转移性Ｈｅｐ３Ｂ细胞系比较，有１６秽爨自在ＭＨ— ＣＣ９７Ｈ和ＭＨＣＣ９７Ｌ高装达，ｌＯ种鬣盘低表达，说明各种蟹 白质共同导致肝细胞癌转移。对差异蛋白Ｓ１００Ａ４与肝癌转 移的研究提承，Ｓ１００Ａ４邋过增强肝癌细胞的运动侵袭能力 朔上酒ＭＭＰ麓分泌，参与瑟癌缡瘛的侵袭翻转移蓬程。 Ｚｈｏｕ等¨４ｏ采用２．ＤＥ及ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ／ＭＳ及多种复合蛋 囱质组学（ＭＰ）技术对人非肝癌但融发生变化的肝细胞系、
作者麓介：侯振渡，男，教授。Ｔｅｌ：（０３１７）５５０７８０５，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｏｕｚｈｅｎ－
ｉｉａｎｇ＠ｓｉｎａ。∞ｍ
万方数据
・２。６・
穆露与实验癌理学杂志Ｊ
Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ
２００９
Ａｐｒ；２￥（２）
和蒸馏收集。克服了２－ＤＥ的缺点，搡作简单、自动化程度高， 薅化了信息处理，提高了低丰度蛋白藤、膜蛋白、分子量特舅《 欠裰待剐小的蛋自爱的分离检测魏力，且西敢率离，藐操持 鬻白质的完憋性和活力。Ｊｉｎ等¨州用此方法获得Ｉ ２９２个鬣 国质，认为多维液相色谱是一项简单丽有效的蛋白预处理方 法，菲索有蘩ｌ予盘清蛋巍矮缓学骚究。Ｓｍｆｉｍ等遥避使矮糨 薤１个ｐＨ范围的多重ｐＨ固相梯度（ＩＰＧ）干胶条，提高了２・ ＤＥ的分离效率，经ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＬＣＭＳ／ＭＳ联合质谱分析，使 蟹鑫震鉴定鹃效率挺离２倍，并锺改簧投酸、缀碱栏蛋鸯虞 的分离鉴定效果。用免疫方法除去皿浆中６种生要蛋白质， 用脱离凝胶电泳（ＯＧＥ）技术进行ｍ清／血浆蛋囱质组分析， 经过２个步骤将完整的援囱质和胶段分鼹成教在的滚态麓 段，再用ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ／分析肽片段¨“。采用空瘦斑液，离心沉 淀吸取血清，分装一８０℃冻存，效果较好。选择ＩＰＧ胶条， 一般应选ｐＨ
骆廉舄实验病理学杂志Ｊ
Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ
２００９
Ａｐｒ；２，５（２）
・２０５・
比较蛋白质组学在肝癌研究中的进展
侯振江
关键词：比较蛋囱质组学；肝肿瘤
中阕分类号：Ｒ ７３５．７
的差异蛋白表达情况【５ｌ。 １．２质谱技术通过质谱分析能清楚地鉴定蛋白质，并准 确地测量敷稻蛋白黢的摆对分子质量、氨基黢序列及翻｛謦螽 的嫠饰，舆有高灵敏麓裙离准确发，置容易蜜琥自动纯，燕蛋
文献标识码：Ａ
文章编号：１００１—７３９９（２００９）０２－０２０５一∞ 随着人类全基因组计划的完成，生命科学的研究重点由 基因转移到蛋巍壤土来，蛋内质组学（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）应运面生。 螽者以蛋白凌缱为穆｝究对象，以全瑟蛋爨覆懿往璇为研究基 础，在蛋白质水平探讨对疾病机制、细胞模式和功能联系的 科学…。采用黼分辨率的鬣自质分离手段，结合高通量的蛋 鸯璇鉴定技拳，全嚣研究特定馕瑟下蛋邃覆的表达游。蛋自 质疑有动态性、多样性、时州性、夺闯憔和特异性，煎合成受 多因素的调控。不同的组织细胞蛋白质的合成、表达的种类 秘数量袁疆大懿差巽，鄹缝细胞发育豹不羁阶段，其蛋囊覆 组的构成也在不断的变化。因此，蛋白质组是在空闻和时闻 上幼态变化着的整体，分析不同条件下疆白质组的变化，发 现稻鉴定不弼生理条件下蛋鑫质组的成分差异，是玩较蛋自 质缀学酶研究斑容珏ｊ。，鄄跑较不同蟹稻质缰之闻蛋白震在 表达数量、表达水平和修饰状态上的差撵。本文就比较蛋白 质缀学及其在肝细胞癌研究中的进展进行综述。 ｌ比较蛋白质组学的研究方法 比较蛋白质组学是蛋趣艨组学研究的一个分支，常用的 磷究方法包耩黢嗣凝胶毫泳、质谱技零、溺位素亲翻标签。 １．１双向凝胶电泳（２－ＤＥ）技术２－ＤＥ可以把复杂混合物 中的疆白质在二维平面上很好地分开，并对分离出的蛋白质 斑点进行定毪稀定量分橇。蠡然对羝誊度蛋自覆娥敬辨舅《， 操作要求较高，但其通量和炙敏度高，分辨率和蓖复性好，与 质潜技术联合Ｊ血用成为目前最流行最可靠的技术平台”ｊ。 激光簇获显徽甥割本（ＬＣＭ）霹降低２－ＤＥ分折样熬孛组织 的弊质性，提商分辨率，并有助于比较磁常弓肿瘤缓织蛋白 质淡达的差异，ＬＣＭ与２－ＤＥ结合使分辨率进一步得到改 善。差异凝胶魄泳＜ＤＩＧＦ）将薅个样品殛窘覆分别媸不同的 荧光染料遂行椽记，然后等链混合荠邂行２－ＤＥ，蠢予荧光染 料的发光波长不同，使问一块凝胶上＿两个样品蛋融质分离， 避免了电泳时的人为误差及胶与胶之阅的差异，保证结果的 霹纛经，显灵敏凌毒予英德方法，筏准确反映榉菇秘对嚣瑟
９００
寒转移酶ＨＣＣ缨戆系一珏哂Ｂ、煮溲转移静ＨＣＣ缨憨系
２ＭＨＣＣ９７Ｈ
Ｄ豹蛋自在ＨＣＣ缝绶痰达主溺，藏蛋自
３种细胞系的蛋白进行分析，发现３种细胞系的
峰的强度与患者的年龄、性别、ＡＦＰ水平等无关，但与肿瘤的 大小成正比。体外实验证实，此蛋白为玻连蛋白的羧基末 蜈，东ＨＣＣ表达增蹇，霹反映ＨＣＣ戆侵袭牲。霆毙，璇连蛋 白的羧基末端多肽可望成为ＨＣＣ新的血清标记物。Ａｎｇ 等【２¨用凝集索亲和提纯法和２－ＤＥ进行研究，发现ＨＣＣ患 者Ｈｐ浓度明显舞亵，直清ｓ一挂ｐ穰Ｆ．Ｈｐ黪纯纯霹丰蹇ＨＣＣ 的糖鏊化变异体。Ｈｐ和ＡＦＰ联合用予诊断ＨＣＣ静特异性
３～１０
ＤＨ－２的２个变异体消失，且ＡＬＤＨ．３和ＡＬＤＨ－２变异体的相 伴出现和消失在备侧ＨＣＣ申均发生，提示ＡＬＤＨ阕工酶变 舅俸的变化与ＨＣＣ密切专嚣关。Ｋｉｍｉｌ副等瘸２一ＤＥ对１１例翳 癌组织和配对正常肝组织蛋内图谱进行分析，发现表达量相 差３倍以上，且至少在３０％的配对组织巾均有相同变化的 蛋岛鼹点，ＨＳＰ２７、组织蛋鑫黪Ｄ稷生长戮子受俸结会蛋鑫２ 等在ＨＣＣ发生和演化过程中起重要作用。进一步比较２１ 例ＨＣＣ和自身藏常对照组织的蛋白表达图谱，鉴定了６０个 翳瘗组织纛毒≥瘗缀织孛差异衮达夔蛋自爱点，其孛１４静蛋 白质猩ＨＢＶ、ＨＣＶ相关性ＨＣＣ和非病毒相关性ＨＣＣ ３种类 型ＨＣＣ中均有相同的变化趋势，而其余４６种则存在病毒感 染的特异性，翔ＨＰＳ２７在ＨＢＶ耀关性ＨＣＣ孛表达下漏，纛 在ＨＣＶ相关性ＨＣＣ中表达上调，硫代硫酸转硫酶在ＨＢＶ 相关性ＨＣＣ和非病毒相关性ＨＣＣ中表达上调，而猩ＨＣＶ 相关键ＨＣＣ申裘达无差舅。Ｙｏｋｏｙａｍａ等¨副利髑２・ＤＥ－ ＴＯＦ－ＭＳ分析了肝癌和癌旁缆织的蛋自璇组成分的差异，发 现１１个差异蛋白质点，经过ＭＡＬＩＤ—ＴＯＦ浆定及肽质攮指纹 数据痒搜索到８个在肝癌组织中表达均下弱的蛋白艨点，其 孛有肝型醛缩酶、原螽瑾球蛋秘８链、栗糖激酶、烯酰耱酶Ａ 水化酶、转铁蛋白轻链以及精氮酸酶ｌ等，这些蛋白都与肝 癌形成有关。Ｓｏｎｇ等ｍ１用２，ＤＥ分离１２例ＨＣＣ患者（转移 耨来转移各６镶）肝组织蛋爨，薅诗算撬圈像分街软释分析 两组擞白质的变化，并用ＭＳ进行鉴定，筛选出与侣伴蛋白、 细胞流动性、细胞支架结构有关的１６种缀自，包括ＨＳＰ２７、
糖蛋白及总蛋白表达有明显差异。 ３。２翳瘥维织蛋岛殿缓学霹提供缨戆或组织蛋叁的表达 率度，通过比较病态与藏常细胞内鬣自表达的麓异，找到有 效的肿瘤标志物。Ｐａｒｋ簿用２－ＤＥ和ＭＡＬＤＩ—ＭＳ技术分析 ｌＯ倒ＨＣＣ患者懿癌组织和邻近菲痿缀织，发现ＨＣＣ组织中 隧脱氢酶（ＡＬＤＨ，中ＡＬＤＨ一１的４个变异体保持不变，Ａｂ
收稿日期：２００９—０ｌ一２５ 基金竣疆：淫北豢辩学技术发缀耱援麓项曩（０５２７６１２８８） 律鬻单位：沧州暇学高等专科攀校医学技术系检验学最主要的鉴定技术。液面增强激光解析电离臆谱 （ＳＥＩ，ＤＩ—ＭＳ）与不同性质的蛋自质芯片结合，综合了芯片微 阵列技零与质谱两者豹优点，瓣麓＋ｆ对蛋自疆的鉴定熊力， 可直接榆测样品中目标蛋白质的分子量、ＰＩ、糖基化位点和 磷酸化位点等参数ｍｊ。将蛋白质芯片与ＳＥＬＤＩ—ＭＳ和激光 舞析电褒纯飞行时闽震谱（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ—ＭＳ）耀结合，霹瀑我 差异表达的蛋白质。与液相色谱（ＬＣＭＳ／ＭＳ）联用，可鉴定 复杂样晶中低丰度蛋白质，具有快速、敏感、分辨率高、梭测 莛隧大翻不露样品处疆等优点，霹罴手瞒臻大规模蛋自骥组 分析‘”。 １．３同倥素亲和标签（ＩＣＡＴ） 将两种ＩＣＡＴ试剂标记处
Ａｕｒｕｍ
亲合柱、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＡＲＳ亲合柱、制备溶液等电聚焦法Ｒｏｔｏｆｏｒ 和有机溶剂沉淀法进行比较，结果选择了Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＡＲＳ亲 会桂臻予瘦浆／盘漶梯麓的处理，完成了标瞧纛浆／盘清榉瑟 的分析比较及鉴定。证实血清样晶经特殊预处理，再与多种 技术相结合，才能较清晰地显示凝白的表达情况。用免疫亲 季瑟吸附法去除斑渣巾的离丰瘦鬣爨，再用色谱方法（包括离 子交换色谱和分子筛色谱），预分离血清蛋翔，将富集的低丰 度蛋白成分用２一ＤＥ分离，得到ｊ艟３ ７００个蛋内质点的电泳图 谱。这些蛋白质点用ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ鉴定，将来能成功燕定 的蛋裔旋点用ＬＣ・ＭＳ／ＭＳ串联黢谱分析，共浆定窭３２５个完 整的蛋白质。血清鬣白先经多维色谱分离，采用色谱聚焦和 无孔填料反向色谱分离技术，备分离组分经胰蛋白酶酶解后 矗接遘行疆谱鋈定，实瑰了蛋蠢艨静超裹分辨率分离、分析
于不同状态下缨施巾戆半魏氨酸，摹｜ｊ爆事联矮谱技拳，对混 合样品送行分析，能准确比较两个样品蛋自矮表达水平的不 同。该技术可直接检测混合样黼，快速进行定性和定墩，鉴 定低丰度蛋白质，能迅速找出露簧功能蛋囱壤，尤其是膜蛋 白等疏水性蛋白质１８ｊ。僵不能分析不含ｃｙｓ的蛋自履，也存 在安全和操作上的局限性。 ２标本的处疆 组织、细胞和ｍ清中的蛋白有明显的不同，如血清蛋白 数量最多、不列豹蛋内质含量差别极大、低丰度蛋白质的种 类多，磊缀不稳定。趣清蛋臼缫学戆标本簸建常采惩染色 法、液相层析法、免痰岽合法等去除高丰度磁白质。用商品 试剂盒除去高丰度疆向质，简便、快速，但也可能会非特异性 吸附部分蠢、分子量低丰度蛋鑫质。毯等≯３对Ｂｉｏ—ｒａｄ