血红蛋白的提取与分离2011.01.(xu)
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学习目标 1. 理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理 理解色谱法、 2. 了解缓冲液的组成及其作用 3. 血红蛋白的分离－－样品处理 血红蛋白的分离－－ －－样品处理
一、基础知识――蛋白质提取和分离原理 基础知识――蛋白质提取和分离原理 ―― 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物化理性质： 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物化理性质： －－蛋白质的物化理性质 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。 亲和力等千差万别。 分离 方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法
2．凝胶电泳法： ．凝胶电泳法： （1）原理： ）原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
二、实验操作－－实验步骤 实验操作－－实验步骤 －－ 样品处理 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 洗 粗 分 离 2.释放血红蛋白 释放血红蛋白 释放 纯 化 3.分离血红蛋白 分离血红蛋白 分离 纯度鉴定 4.透析血红蛋白 透析血红蛋白 透析
血液组成成分 阅读思考： 阅读思考： 血浆 血细胞 两部分组成。 1. 血液由______和________两部分组成。 血液由______和________两部分组成 2. 血细胞中 红细胞 细胞数量最多，该细胞的含 血细胞中________细胞数量最多， 细胞数量最多 量最高的化合物是_____________。 量最高的化合物是 血红蛋白 。
2．凝胶电泳法： ．凝胶电泳法： （2）分离方法： ）分离方法： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （3）分离过程： ）分离过程： 在一定pH下 使蛋白质基团带上正电或负电； 在一定 下，使蛋白质基团带上正电或负电； 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合 ，形成“蛋白质－ 加入带负电荷多的 复合 使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 迁移速率仅取决于分子大小 物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
1.洗 涤 红 细 胞 洗 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程： 洗涤过程： 吸出血浆 5倍体积生理盐水 倍体积生理盐水 3g柠檬酸钠 柠檬酸钠 血液 100mL 低速离心 2 min 血 浆 红细胞
红细胞
搅拌10min 搅拌
重复洗涤3次 重复洗涤 次，直至上清液没有黄色
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 促使蛋白质分子的差速流动。
1.凝胶色谱法 1.凝胶色谱法 －－洗脱剂 （3）缓冲溶液－－洗脱剂 ）缓冲溶液－－ 组成： 组成： 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等 作用： 作用： 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 稳定。 抵制外界酸碱对溶液 的干扰而保持 pH稳定结
血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法 原 凝胶电泳法 缓冲溶液 蛋白质的 提取分离 纯度鉴定 纯 化 组 成 作 用 凝胶色 谱法 理 分离过程
样品处理
粗 分 离
3.分离血红蛋白 分离血红蛋白 分离 分离过程
离心——过滤 过滤——分液漏斗分离 离心 过滤 分液漏斗分离
红细胞 混合液
脂类物质
滤纸 高速离心 10min
离心管
过滤
烧杯
4.透析血红蛋白 透析血红蛋白 透析
作用？ 作用？
1mL
1mL
20mmol/L磷酸缓冲液 磷酸缓冲液
注意事项
1. 红细胞的洗涤： 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理： 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短， 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填： 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
1.凝胶色谱法 1.凝胶色谱法 （1）原理： ）原理： 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
1.凝胶色谱法 1.凝胶色谱法 （2）分离过程 ） 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子
2.释放血红蛋白 释放血红蛋白 释放 阅读思考： 阅读思考： 1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 释放血红蛋白过程中， 哪些物质？ 哪些物质？ 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析： 目的分析： 使红细胞大量吸水胀裂 1. 蒸馏水的作用是 蒸馏水的作用是______________________________。 。 2. 加入甲苯的作用是 溶解红细胞的细胞膜 加入甲苯的作用是____________________________。 。 3. 充分搅拌的目的是 加速红细胞的破裂 充分搅拌的目的是____________________________。 。
一、基础知识――蛋白质提取和分离原理 基础知识――蛋白质提取和分离原理 ―― 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物化理性质： 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物化理性质： －－蛋白质的物化理性质 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。 亲和力等千差万别。 分离 方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法
2．凝胶电泳法： ．凝胶电泳法： （1）原理： ）原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
二、实验操作－－实验步骤 实验操作－－实验步骤 －－ 样品处理 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 洗 粗 分 离 2.释放血红蛋白 释放血红蛋白 释放 纯 化 3.分离血红蛋白 分离血红蛋白 分离 纯度鉴定 4.透析血红蛋白 透析血红蛋白 透析
血液组成成分 阅读思考： 阅读思考： 血浆 血细胞 两部分组成。 1. 血液由______和________两部分组成。 血液由______和________两部分组成 2. 血细胞中 红细胞 细胞数量最多，该细胞的含 血细胞中________细胞数量最多， 细胞数量最多 量最高的化合物是_____________。 量最高的化合物是 血红蛋白 。
2．凝胶电泳法： ．凝胶电泳法： （2）分离方法： ）分离方法： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （3）分离过程： ）分离过程： 在一定pH下 使蛋白质基团带上正电或负电； 在一定 下，使蛋白质基团带上正电或负电； 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合 ，形成“蛋白质－ 加入带负电荷多的 复合 使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 迁移速率仅取决于分子大小 物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
1.洗 涤 红 细 胞 洗 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程： 洗涤过程： 吸出血浆 5倍体积生理盐水 倍体积生理盐水 3g柠檬酸钠 柠檬酸钠 血液 100mL 低速离心 2 min 血 浆 红细胞
红细胞
搅拌10min 搅拌
重复洗涤3次 重复洗涤 次，直至上清液没有黄色
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 促使蛋白质分子的差速流动。
1.凝胶色谱法 1.凝胶色谱法 －－洗脱剂 （3）缓冲溶液－－洗脱剂 ）缓冲溶液－－ 组成： 组成： 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等 作用： 作用： 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 稳定。 抵制外界酸碱对溶液 的干扰而保持 pH稳定结
血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法 原 凝胶电泳法 缓冲溶液 蛋白质的 提取分离 纯度鉴定 纯 化 组 成 作 用 凝胶色 谱法 理 分离过程
样品处理
粗 分 离
3.分离血红蛋白 分离血红蛋白 分离 分离过程
离心——过滤 过滤——分液漏斗分离 离心 过滤 分液漏斗分离
红细胞 混合液
脂类物质
滤纸 高速离心 10min
离心管
过滤
烧杯
4.透析血红蛋白 透析血红蛋白 透析
作用？ 作用？
1mL
1mL
20mmol/L磷酸缓冲液 磷酸缓冲液
注意事项
1. 红细胞的洗涤： 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理： 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短， 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填： 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
1.凝胶色谱法 1.凝胶色谱法 （1）原理： ）原理： 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
1.凝胶色谱法 1.凝胶色谱法 （2）分离过程 ） 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子
2.释放血红蛋白 释放血红蛋白 释放 阅读思考： 阅读思考： 1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 释放血红蛋白过程中， 哪些物质？ 哪些物质？ 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析： 目的分析： 使红细胞大量吸水胀裂 1. 蒸馏水的作用是 蒸馏水的作用是______________________________。 。 2. 加入甲苯的作用是 溶解红细胞的细胞膜 加入甲苯的作用是____________________________。 。 3. 充分搅拌的目的是 加速红细胞的破裂 充分搅拌的目的是____________________________。 。