罗非鱼鱼鳞胶原寡肽制备

罗非鱼鱼鳞胶原寡肽制备
邓晓龙;高德友;胡建兰;林丽繁;胡建恩
【摘要】罗非鱼鱼鳞经水洗、酸浸、碱浸处理后,采用热水法提取胶原蛋白并对其进行酶解,以酶解液水解度为指标筛选适合的酶,研究酶添加量、酶解时间、底物浓度和酶解温度对水解度的影响.在单因素实验的基础上,通过正交实验优化鱼鳞胶原蛋白的酶解条件.实验结果表明:当酶添加量6 000 U/g、酶解时间8h、底物浓度5％、酶解温度50℃时,鱼鳞胶原蛋白酶解液水解度最大,达到24.23％.此条件下制备的分子量小于1 000 Da胶原寡肽占82.40％.
【期刊名称】《福建水产》
【年(卷),期】2015(037)006
【总页数】7页(P471-477)
【关键词】罗非鱼鱼鳞;酶解;水解度;胶原寡肽
【作者】邓晓龙;高德友;胡建兰;林丽繁;胡建恩
【作者单位】石狮海星食品有限公司,福建石狮362711;石狮海星食品有限公司,福建石狮362711;石狮海星食品有限公司,福建石狮362711;石狮海星食品有限公司,福建石狮362711;大连海洋大学,辽宁大连116023
【正文语种】中文
【中图分类】S937.3
罗非鱼的肉质细嫩，味道鲜美，含有多种不饱和脂肪酸和丰富的蛋白质，已成为我国淡水水产品出口量最大宗的主导品种之一[1]，在罗非鱼的加工过程中会产生约
占体重1%～2%的鱼鳞。

鱼鳞是鱼皮真皮层的变形产物，有机物占41%～55%，磷酸钙占38%～46%[2]，其中，有机物主要是胶原蛋白和角质蛋白，是一种良好的胶原蛋白提取原料。

全世界每年约产生4×104 t的罗非鱼鱼鳞废弃物，从罗非
鱼加工废弃物中获取胶原蛋白并制备活性肽，既减少环境污染，又能够充分利用现有资源，实现变废为宝，提高企业的经济效益。

胶原寡肽是人体主要结构蛋白——胶原蛋白的水解产物，具有抑制血管紧张素转
化酶(ACE)活性和抗氧化活性，可广泛应用于食品、保健品、化妆品等领域[3]。

有关水产动物胶原寡肽的报道已屡见不鲜，已经从鲢鱼[4]、鳕鱼[5]、鱿鱼皮[6]胶原蛋白的水解产物中分离得到了具有抑制ACE作用的短肽，并开发了许多相应的产
品投入市场。

但从鱼皮中提取的胶原寡肽粗脂肪含量较高，且产品色泽暗沉，感官品质不佳。

目前国内对从罗非鱼鱼鳞制备提取胶原寡肽的报道较少，宋芹[3]等将
罗非鱼鱼鳞适当粉碎后进行预处理，利用高压蒸煮法提取胶原蛋白，再用酶解法制备胶原蛋白寡肽。

此方法胶原寡肽得率较高，但由于是将鱼鳞粉碎后进行处理，鱼鳞中的角质蛋白等杂蛋白无法去除，导致胶原寡肽纯度低。

本实验以水解度为指标，研究从罗非鱼鱼鳞制备高纯度胶原寡肽的最佳酶解工艺，旨在充分利用大宗的罗非鱼加工副产物——鱼鳞，为工业化生产罗非鱼鱼鳞胶原寡肽提供借鉴。

1.1 材料和试剂
罗非鱼鱼鳞：雷州市乌石镇龙之润水产品加工厂。

试剂：茚三酮、磷酸一氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备
电子分析天平：北京赛多利仪器系统有限公司；恒温酶解装置：常州国华电器有限公司；PHS-3C精密酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SHZ-D循环水式
真空泵：河南省予华仪器有限公司；Scients-10N冷冻干燥机：宁波新芝生物科
技股份有限公司；可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；Waters 1525
高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Empower工作站GPC软件)：美国Waters公司。

1.3 实验方法
1.3.1 罗非鱼鱼鳞基本成分测定
分别取适量罗非鱼鱼鳞测定基本组成成分。

水分含量的测定：GB/T 5009.3-2010直接干燥法；灰分的测定：GB/T5009.4-2010灼烧称重法；蛋白质含量的测定：GB/T5009.5-2010凯氏定氮法；脂肪含量的测定：GB/T 5009.6-2003索氏抽提法。

1.3.2 罗非鱼鱼鳞胶原蛋白提取
罗非鱼鱼鳞胶原蛋白的提取方法参考刘艳[7]的方法并稍作改进。

称取鱼鳞500 g，用自来水(1∶10 w/v)清洗2次，每次0.5 h，以去除泥沙和漂浮物；然后用2%的HCl溶液(1∶10 w/v)处理4 h，以脱除钙盐并打开胶原蛋白与其他物质间形成的
共价键；再用0.5%的NaOH溶液(1∶10 w/v)处理4 h，每2 h换一次NaOH溶液，以脱除部分杂质蛋白和色素；最后将鱼鳞置于沸水中加热2 h，过滤液浓缩后冷冻干燥即得胶原蛋白。

1.3.3 酶解液水解度的测定方法
采用茚三酮法[8]测定酶解液的水解度。

1)标准曲线绘制制备0.5 mg/mL的罗非鱼鱼鳞胶原蛋白完全水解液，分别取完全水解液0.10、0.25、0.40、0.55、0.70、0.85和1.00 mL(对应蛋白质含量分别为0.050、0.125、0.200、0.275、0.350、0.425和0.500 mg)，加1.0 mL pH 8.0的磷酸缓冲液和1.0 mL2.0%茚三酮溶液，密封后沸水浴加热15 min，冷却后加
蒸馏水稀释至25 mL，测定570 nm处吸光度值；配制相同浓度的蛋白质溶液，
按上述方法测定吸光度值。

以相应浓度条件下测定的吸光度值之差为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准工作曲线。

2)酶解液水解度测定取4.0 mL酶解液稀释至100 mL，过滤，按上述方法测定并计算对应蛋白质浓度吸光度值之差，从工作曲线上计算蛋白质含量，按公式计算蛋白质水解度。

DH%=(A/1000W)×V1×(100/V2)×100%
A——蛋白质毫克数
W——酶解液胶原蛋白质量(g)
V1——水解液总体积(mL)
V2——显色时所用稀释液的体积(mL)
由图1可知，罗非鱼鱼鳞胶原寡肽水解度标准曲线的回归方程为y=1.550 2x-
0.083 9，其中相关系数R2=0.999 2，表明该方程拟合度良好，可信度高。

1.3.4 单因素实验
选取酶种类(木瓜蛋白酶：来源未成熟木瓜果实，活力80×104U/g；中性蛋白酶：来源枯草芽孢杆菌，活力20×104 U/g；碱性蛋白酶：来源地衣芽孢杆菌，活力
20×104 U/g)、酶添加量、酶解时间、底物浓度和酶解温度进行单因素实验，以
茚三酮法测定的水解度为指标，研究各因素对罗非鱼鱼鳞胶原寡肽水解度的影响。

1.3.5 正交实验
以单因素实验结果为基础，选取适宜的酶，并对其添加量、酶解时间、底物浓度和酶解温度水平设计正交实验，运用极差分析法分析不同因素对酶解液水解度的影响，研究酶解最优水平。

1.3.6 胶原寡肽分子量分布
将在最佳酶解条件下制备的胶原寡肽粉配制成20%的溶液，灭菌后送江南大学分
析测试中心检测分子量。

样品制备：取样品0.5 mL左右于10 mL容量瓶中，用
流动相稀释至刻度，超声5 min，离心后微孔过滤膜过滤后供进样。

色谱条件：色谱柱：TSK gel 2000 SWX L 300 mm×7.8 mm；流动相：乙腈/水/
三氟乙酸，40/60/0.1(V/V)；检测：UV220 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：30℃。

分子量校正曲线所用标准品：
1.细胞色素C(MW12384)
2.杆菌酶(MW1422)
3.乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)
4.乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)
2.1 罗非鱼鱼鳞基本组成成分分析
由表2可知，罗非鱼鱼鳞粗蛋白含量为47.70%，与草鱼鱼鳞[9]50.54%类似，灰分含量为36.12%，主要为羟基磷灰石等钙盐，需要在前处理时用盐酸将其脱除，水分和粗脂肪含量分别为14.22%和2.18%。

测定结果表明，罗非鱼鱼鳞是一种良好的蛋白质原料，且粗脂肪含量低，不需要复杂的前处理工艺。

2.2 单因素实验结果分析
2.2.1 酶种类对水解度的影响
选择木瓜蛋白酶(55℃，pH5.7)、中性蛋白酶(50℃，pH7.0)和碱性蛋白酶(55℃，pH10.0)，在酶添加量6 000 U/g、酶解时间6 h、底物浓度4%、酶解温度50℃条件下进行实验，结果如图2所示。

由图2可知，采用不同酶在各自最适温度和pH条件下进行酶解的水解度不同，碱性蛋白酶和中性蛋白酶的水解度分别为23.39%和23.27%，比木瓜蛋白酶水解度高，考虑到增加调节pH过程会增加成本，所以选择中性蛋白酶进行后续单因素实验。

2.2.2 酶添加量对水解度的影响
设置酶添加量分别为1 000、2 000、4 000、6 000、8 000 U/g，在酶解时间6 h、底物浓度4%、酶解温度50℃条件下进行实验，结果如图3所示。

由图3可知，酶解液的水解度随酶添加量的增加而提高，当添加量达6 000 U/g 后，水解度增加缓慢，因为蛋白酶水解蛋白质具有专一性，会在特定的切割位点将长链蛋白质切开，其它条件一定时，再增加同一种酶的添加量并不会增加切割位点，所以酶解液的水解度不会继续增加。

因此选择酶添加量6 000 U/g进行单因素实验。

2.2.3 酶解时间对水解度的影响
设置酶解时间分别为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h，在酶添加量6 000 U/g、底物
浓度4%、酶解温度50℃条件下进行实验，结果如图4所示。

由图4可知，酶解液的水解度随酶解时间的延长而提高，酶解时间6 h时，水解
度为24.11%，继续延长酶解时间不能提高酶解液水解度，因为酶具有高效性，酶解刚开始时迅速发挥作用，水解度迅速提高，随时间延长水解度趋于稳定。

因此选择酶解时间6 h进行单因素实验。

2.2.4 底物浓度对水解度的影响
设置底物浓度分别为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，在酶添加量6 000 U/g、在酶解时间6 h、酶解温度50℃条件下进行实验，结果如图5所示。

由图5可知，底物浓度对酶解液的水解度影响不大，随底物浓度增加，水解度缓
慢降低，底物浓度超过4%后，降低趋势较明显，在其它条件都相同的条件下，底物浓度越低，酶与底物接触得越充分，所以水解度相对较高。

因此选择底物浓度4%进行单因素实验。

2.2.5 酶解温度对水解度的影响
设置酶解温度分别为20、30、40、50、60℃，在酶添加量6 000 U/g、在酶解
时间6 h、底物浓度4%条件下进行实验，结果如图6所示。

由图6可知，酶解液的水解度随酶解温度的升高先增加后降低，温度为50℃时，
水解度达到最大，为26.61%。

这是因为每种酶都有其发挥催化功能的最适温度，
温度低酶活力受到抑制，不能充分发挥酶的作用，温度高可能导致部分酶活力丧失，水解度降低，因此选择50℃为酶解温度。

2.3 正交实验结果及分析
根据单因素实验结果，选取酶添加量、酶解时间、底物浓度和酶解温度4个因素
进行4因素3水平的正交实验，以酶解液水解度为指标，确定最佳酶解条件。

由表3极差分析结果可知，影响罗非鱼鱼鳞胶原寡肽水解度的因素主次顺序为
D>A>B>C，即酶解温度>酶添加量>酶解时间>底物浓度，胶原寡肽制备的最佳
工艺为A3B3C1D2，通过比较发现，在实验选定的范围内，底物浓度对水解度基
本无影响，考虑到后期浓缩干燥工作量，选取底物浓度为5%，酶添加量6 000
U/g和8 000 U/g的K值相差不大，为节约成本选取酶添加量6 000 U/g，可以
把最佳提取工艺修订为A2B3C3D2。

根据修订的工艺进行验证实验，测得水解度
为24.23%，与A3B3C1D2水解度为24.32%相差很小，因而选定A2B3C3D2为最佳提取工艺，即酶添加量6 000 U/g、酶解时间8 h、底物浓度5%、酶解温度50℃。

2.4 分子量检测结果
由表4可知，实验制备的罗非鱼胶原寡肽分子量小于1 000 Da的占82.40%，分子量小于500 Da的占52.83%，实现了制备高水解度、低分子量胶原寡肽的目标。

后期需要对其ACE抑制和抗氧化等生物活性进行测定，以量化数据，为其推广应
用提供理论基础。

通过单因素实验，确定酶解条件为：中性蛋白酶酶解、酶添加量6 000 U/g、酶
解时间6 h、底物浓度4%、酶解温度50℃。

对中性蛋白酶酶解条件进行研究，得出适宜酶解条件为酶添加量6 000 U/g、酶解时间8 h、底物浓度5%、酶解温度50℃，此条件下酶解液的水解度为24.23%，肽分子量小于1 000 Da的占
82.40%。

Enzymes are biological macromolecules having biocatalyst functions,which generally consist of amino acid，so most of them are protein essentially.Enzymes have some characters，such as high efficiency，specificity and instability.Therefore，different enzymes must be selected
for specific raw material，the optimal hydrolysis conditions need to be researched.Enzyme dosage，hydrolysis time，substrate concentrations
and hydrolysis temperature are the main factors which play important roles on hydrolysis effect.
Collagen peptides emerging as a new functional protein ingredient were developing rapidly in domestic and abroad in recent years.In order to investigate the theory for deeper research of tilapia scale，the optimum extracting conditions of collagen peptides from tilapia scale were carefully and comprehensively studied in this paper.Scale was processed by washing，acid leaching，and alkaline leaching.Then collagen was extracted by using boiled water to incubate for 2 hours.Tilapia fish scale collagen protein was hydrolyzed by enzyme and hydrolysis degree of hydrolyzed liquid was detected.The optimal enzyme was selected in the norm of the hydrolysis degree of hydrolyzed liquid，and then the influences of enzyme dosage，hydrolysis time，substrate concentrations and hydrolysis temperature on hydrolysis degree were studied.Based on the single factor experiment results，orthogonal experiments were carried out to research the optimal hydrolysis conditions.The results showed that：in the conditions of enzyme dosage 6 000 U/g，hydrolysis time 8 h，substrate concentrations
5%，hydrolysis temperature 50℃，the hydrolysis degree of tilapia scale collagen protein peptides reached a maximum value，which was 24.23%，and the molecular weight of the 82.40% sample was less than 1 000 Da.【相关文献】
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