Hif-1靶基因Bnip3在肝星状细胞活化中调控自噬机制的研究

目录
英文缩略词 (2)
一、摘要 (4)
1.中文摘要 (4)
2.Abstract (6)
二、正文 (8)
1.前言 (8)
2.材料方法 (15)
3.结果 (24)
4.讨论 (33)
5.参考文献 (37)
三、综述 (43)
1.正文 (42)
2.参考文献 (50)
四、致谢 (55)
五、附录1 (56)
英文缩略词
缩略词英文全称中文名
Bcl-2 B-cell lymphoma-2 B淋巴细胞瘤-2基因
Bnip3 bcl-2／adenovirusE1B19一kDa interacting
protein 3 Bcl-2/E1B-19kDa 相互作用蛋白3
ER endoplasmic reticulum 内质网
ECM extracellular matrix 细胞外基质
GFAP glial fibrillary acidic protein 胶质纤维酸性蛋白HSC hepatic stellate cell 肝星状细胞
Hif-1 hypoxia inducible factor-1 缺氧诱导因子-1 HRE hypoxia responsive element 缺氧反应元件
IF immunofluorescence 免疫荧光技术
IHC immunohistochemistry 免疫组织化学技术LC3 microtubule-associated proteins light chain 3 微管相关蛋白轻链3 LPS lipopolysaccharide 脂多糖
MFB myofibfoblast 肌成纤维细胞
PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液
PVDF polyvinylidene fluoride 聚偏二氟乙烯
qPCR real-time quantitative polymerase chain
reaction
实时荧光定量聚合酶链式反应
siRNA small interfering RNA 小干扰RNA
α-SMA α-smooth muscle actin α-平滑肌肌动蛋白PI3K class III phosphoinositide 3-kinase 磷酸肌醇3激酶WB western blot 蛋白免疫印迹法
YC-1 3-（5’-hydroxymethy-2’-fury)-1-benzyl
indazole
3-5’-羟甲基-2'-呋喃基-1-苯甲基吲唑
Hif-1靶基因Bnip3在肝星状细胞活化中调控自噬机制的研
究
摘要
目的：肝星状细胞活化是肝纤维化发生发展的关键机制，其活化过程中发生的表型改变已获得认识，但是导致这一系列表型改变的精细机制仍知之甚少。

本课题组前期已证实缺氧诱导因子-1（Hif-1）通过调节自噬影响肝星状细胞的活化，通过全基因组表达芯片分析缺氧诱导的肝星状细胞内自噬相关基因的表达，筛选到与自噬相关的Bnip3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3）蛋白。

在此基础上开展本课题，旨在探讨核转录因子Hif-1靶基因Bnip3调控肝星状细胞活化和自噬的可能机制，以进一步揭示肝纤维化发生发展的相关机制，寻找逆转肝纤维化的靶点。

方法：采用氯化钴（CoCl2）化学诱导缺氧法刺激人肝星状细胞系LX-2细胞，qPCR和Western blot检测LX-2细胞中Bnip3的表达；以日本血吸虫感染小鼠为肝纤维化动物模型，用免疫组织化学染色法检测小鼠肝脏组织中Bnip3的表达；对LX-2进行缺氧处理，Western blot检测P62、α-SMA以及LC3B表达，免疫荧光染色技术检测P62，观察LX-2细胞自噬；用Hif-1抑制剂YC-1抑制Hif-1的表达，缺氧或LPS刺激LX-2细胞，用Western blot和免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测Bnip3表达；用特异性siRNA干扰Bnip3表达，用Western blot检测LX2在缺氧或LPS刺激下α-SMA、LC3B表达；胶原酶消化-Percoll分离法分离BALB/c小鼠的原代肝星状细胞，用Western blot检测原代肝星状细胞自然活化过程中Hif-1、Bnip3和自噬相关分子LC3B和P62以及活化相关分子α-SMA的表达，用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测GFAP、Bnip3及P62的表达；在原代肝星状细胞体外自然活化过程中加入Hif-1抑制剂YC-1，Western blot和免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测Bnip3的表达，用特异性siRNA干扰Bnip3
表达，Western blot检测原代肝星状细胞自然活化过程中α-SMA和LC3B表达。

结果：缺氧处理的人肝星状细胞LX-2和血吸虫肝纤维化小鼠肝脏组织中Bnip3分子表达升高；LX-2缺氧处理后发生自噬；抑制LX-2细胞中Hif-1α表达可减
少Bnip3的表达；干扰LX-2细胞中Bnip3表达可阻抑LX-2细胞自噬发生并抑制细胞活化；小鼠原代肝星状细胞在体外自然活化过程中Bnip3表达升高；原代肝星状细胞自然活化过程中发生自噬且Hif-1α表达升高；抑制原代肝星状细胞中Hif-1α表达，Bnip3表达不再升高；干扰原代肝星状细胞中Bnip3表达，影响肝星状细胞活化和自噬发生。

结论：Hif-1通过靶分子Bnip3调控的肝星状细胞活化和自噬。

关键词：肝纤维化；肝星状细胞；自噬；Hif-1；Bnip3。

Mechanism of Hif-1 target gene Bnip3regulating autophagy and activation of hepatic stellate cells
Abstract
Objective:Activation of hepatic stellate cells (HSCs) is a key mechanism for the occurrence and development of hepatic fibrosis. Phenotypic changes in the process of activation have been recognized, but the precise mechanisms leading to these phenotypic changes are still poorly understood. It has been demonstrated that hypoxia inducible factor-1 (Hif-1) affects the activation of hepatic stellate cells by regulating autophagy. The expression of autophagy related genes in hypoxia-induced hepatic stellate cells was analyzed by whole-genome expression microarray and a differentially expressed autophagy related gene, bnip3 (Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3), was screened out from hypoxia-stimulated LX-2 hepatic stellate cells. The purpose of this study is to explore the possible mechanism of Hif-1 target gene Bnip3 regulating autophagy and activation in hepatic stellate cells, thus to reveal the mechanism of hepatic fibrosis and look for the target of reversing hepatic fibrosis.
Methods: LX-2 cells were treated with CoCl2 and the expression of Bnip3 in LX-2 cells was detected by Real-time quantitative polymerase chain reaction and Western blot. The expression of Bnip3 in liver tissue of mice infected with Schistosoma japonicum was detected by immunohistochemistry. LX-2 cells were treated with hypoxia and the expression of P62, α-SMA and LC3B was detected with Western blot and the puncta of p62 was detected by confocal microscopy. The expression of Hif-1 was inhibited by Hif-1 chemical inhibitor YC-1 and the expression of Bnip3 was detected by Western blot and confocal microscopy in LX-2 cells exposed to hypoxia or LPS treatment. The expression of Bnip3, α-SMA and LC3B in CoCl2-treated or LPS-treated LX-2 cells was tested by Western blot, as Bnip3 expression was interfered by specific siRNA. Primary hepatic stellate cells were isolated from BALB/c mice with collagenase perfusion-percoll separation method and the expression of Hif-1, Bnip3, LC3B, P62 and α-SMA was detected with Western blot during the natural activation of primary hepatic stellate cells. The expression of GFAP,
Bnip3 and formation of P62 puncta were detected with confocal microscopy. Hif-1 chemical inhibitor YC-1 was added into culture medium of primary hepatic stellate cells and Western blot was used to detect the expression of Hif-1 and Bnip3. Bnip3 expression was interfered by specific siRNA and the expression of Bnip3, α-SMA and LC3B was detected by Western blot in primary hepatic stellate cells during natural activation.
Results:The expression of Bnip3 was increased in hypoxia-treated LX-2 cells and in liver tissue of Schistosoma japonicum infected mice. Hypoxia induced autophagy in LX-2 cells. Inhibition of Hif-1α expression reduced the expression of Bnip3 in LX-2 cells. Silencing of Bnip3 expression inhibited autophagy and the activation of LX-2 cells. The expression of Bnip3 increased in the in-vitro naturally activated primary hepatic stellate cells. Occurrence of autophagy and increased expression of Hif-1 was observed in primary hepatic stellate cells. Inhibition of Hif-1α suppressed expression of Bnip3 in primary hepatic stellate cells. Interfering Bnip3 expression with specific siRNA inhibited activation and autophagy of hepatic stellate cells. Conclusion: Hif-1 regulates activation and autophagy of hepatic stellate cells through the Hif-1 target molecule Bnip3.
Key words: hepatic fibrosis; hepatic stellate cells; autophagy; Hif-1; Bnip3.
一、前言
在我国肝病仍是常见病和多发病，罹患各类肝病（病毒性肝炎、血吸虫肝病、酒精性、脂肪性、药物性、自身免疫性、先天代谢性肝病等）的患者人群数目庞大，慢性肝病人群总数高达4亿左右。

在慢性肝损伤期间，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）由静止的、含脂滴的细胞分化为肌成纤维细胞样细胞，增殖速率增加，脂滴数目减少，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）产生增多，逐渐可能发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌[1-2]。

近年来，肝癌已成为我国公众第二大恶性致命肿瘤，因此针对肝纤维化发生发展机制的研究，寻找更多干预手段至关重要。

1.肝星状细胞自噬和活化与肝纤维化的关系
1.1.肝星状细胞的活化与肝纤维化的发生发展
HSC又称Ito细胞或贮脂细胞，是肝损伤时生成ECM的主要细胞来源，约占肝脏所有细胞的13%，位于肝窦周Disse 间隙内，紧贴肝窦内皮细胞和肝细胞[3]。

正常情况下HSC处于静息状态，富含维生素A 和甘油三酯脂滴，为肝细胞提供能源；并参与维持肝脏结构、调节肝血流。

当肝脏受到损伤时，HSC活化转变为其活化形式-肌成纤维细胞（myofibfoblast ，MFB），表现为细胞明显的增殖、收缩性增加、大量表达α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），脂滴丢失等活化特点，并分泌大量细胞因子、趋化因子和ECM 等[4-6]。

ECM代谢失衡，导致其在肝内过度沉积，产生的疤痕逐渐替代肝实质，在肝内形成肝纤维化。

深入了解HSC活化的调节机制可以为治疗慢性肝病指明新的靶点。

1.2.自噬
虽然肝星状细胞活化过程中发生的表型改变已获得认识，但是导致这一系列表型改变的精细机制仍知之甚少。

近年来的研究发现肝星状细胞自噬的发生是促进其活化的重要机制[7]。

自噬是一种细胞内自我分解代谢的调控途径，细胞双层膜包裹包括错误折叠的蛋白质、蛋白质聚合体、损伤的细胞器、脂肪滴，甚至细胞核等细胞内容物形成自噬小体（autophagosome），自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，使包裹的细胞内容物被降解氧化以满足自身的代谢需求，还可以
清除受损的细胞器以防止对细胞造成进一步损伤。

根据不同的分类方法，自噬可分为不同类型。

按照细胞内待降解物被输送至溶酶体内的途径不同，自噬可分为以下三种：大自噬（macroautophagy）即通常所指的自噬，指由内质网来源的膜包绕待降解物形成自噬体，自噬体与溶酶体融合并降解其内容物；小自噬（microautophagy）指溶酶体膜直接包裹蛋白，在溶酶体内降解；分子伴侣介导的自噬（chaperon mediated autophagy，CMA），顾名思义，胞质内待降解蛋白需与分子伴侣结合后，被转运到溶酶体腔中降解。

按照自噬对降解底物的选择性，自噬分为选择性自噬和非选择性自噬两类。

非选择性自噬是指细胞质内的细胞器或者其他胞质成分随机运输到溶酶体降解；而选择性自噬是指对降解底物具有专一性，已发现有线粒体自噬（mitophagy）、脂噬（lipophagy）、内质网自噬（reticulophagy）、过氧化物酶体自噬（pexophagy）等多种对特异性底物选择性降解的自噬，即选择性自噬[8-9]。

自噬在各物种各细胞类型保守存在，目前将自噬的过程描述为起始、延伸、成熟和终止四个阶段，超过30多种参与自噬的特异性基因获得鉴定并被统一命名为自噬相关基因ATG（Autophagy-related gene），包括LC3、Beclin1、PI3K、Atg14、P62、Atg-5、Atg7、Atg9等[10]。

在自噬起始的过程中Beclin1与Atg14结合形成复合物，不断的召集自噬相关蛋白；LC3蛋白定位于自噬小体膜上，Atg14将LC3前体加工为LC3I，在两种泛素化酶即E1样酶和E2样酶的作用下与磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）结合形成LC3II，其有利于自噬体膜的形成和延伸[11]；选择性自噬接头蛋白P62/SQSTM1（sequestome-1）具有与泛素化底物连接的泛素结合结构域（ubiquitin-binding domain，UBA）和能与LC3II结合的LIR结构域（LC3 interaction region，LIR），将底物蛋白运送至自噬溶酶体，最终被溶酶体降解[12-13]。

细胞自噬存在重要的生理和病理学意义，近年来有多个研究报道发现，细胞自噬与包括肿瘤、组织纤维化、肝脏疾病、感染性疾病等多种疾病相关[14-17]。

1.3.自噬在肝脏中的作用
自噬可降解自噬小体内的底物和清除受损的细胞器，对维持细胞内的代谢平衡和生理稳态发挥着不可替代的作用，因此参与了机体一系列的生理或病理过程。

故自噬在肝脏疾病中自噬也发挥重要的作用。

1.自噬促进HSC的活化：在肝损伤过程中，HSC在活化过程中典型的特征是伴随脂滴的丢失。

本课题组曾在日本血吸虫感染小鼠肝纤维化组织中观察到自噬发生，在细胞水平观察到抑制自噬则抑制HSC活化[18]。

脂噬参与的脂滴分解为HSC活化提供能量，从而将HSC从静止态转变为激活态[9]。

有研究发现在小鼠HSCs体外活化培养过程中，自噬通量增加,脂噬选择性降解HSC内的脂滴，脂滴分解为自由视黄酯（free retinoate）释放到细胞外间隙，在脂肪酶的酶解作用下进一步形成自由脂肪酸，促进线粒体内ATP产生和HSC活化；抑制其自噬则减少ATP的产生，从而抑制HSC活化[7]。

CCl4诱导的肝纤维化发生过程中伴随脂噬发生，在特异性自噬相关基因Atg5或Atg7缺失的小鼠中用CCl4诱导小鼠产生肝纤维化，发现小鼠的肝纤维化程度有所好转，分离小鼠肝脏细胞获得的HSC中发现脂滴丢失减少[15]。

有研究表明，给予肝星状细胞抗感染化合物白藜芦醇的刺激，线粒体自噬发生的程度随药物浓度的改变而改变[19]，但是关于线粒体自噬是否与肝星状细胞的活化是否相关尚不清楚。

以上研究提示自噬在HSC 活化过程中能量代谢及表型转化等多方面发挥作用。

2.自噬与肝细胞：已有研究表明当肝细胞受到损伤时会有选择性自噬发生，可降解脂质、糖类等底物，保护受损的肝细胞。

例如脂滴、肝细胞中的Mallory-Denk小体及细胞内受损的内质网、线粒体等细胞器能通过自噬的有效调节进行分解代谢及清除，为肝细胞提供能量和物质的需求，对脂肪性肝病、酒精性肝病及肝损伤性药物所致的肝细胞损伤均起到明显的抑制作用[16,20-22]。

遗传性疾病α1抗胰蛋白酶（α1-AT）缺陷的小鼠中肝细胞发生损伤而致肝纤维化，用自噬诱导剂雷帕霉素诱导肝细胞发生自噬，可发现肝纤维化的程度明显减轻，说明自噬对肝细胞具有显著的保护作用[23]。

故而在肝细胞中保持适当的自噬水平，对于肝脏受损时保护肝细胞具有重要意义。

3.自噬参与肝脏的免疫应答系统：肝炎病毒感染与肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关，在全球流行中以HBV、HCV为主，均难以治愈，病毒性肝炎患者的主要死因是肝硬化。

随着对自噬机制及其与各种疾病之间关系的不断深入研究，发现其与HCV和HBV感染存在一定的关系，在自噬的作用下可增强HBV和HCV在受体细胞内的复制，深入了解HBV、HCV与细胞自噬的关系将为抗病毒治疗提供新的治疗靶点。

近年来的研究发现，HBV X蛋白（HBx）
在HBV感染肝细胞中可增强肝细胞自噬，自噬相关蛋白Beclin1在HBx作用下表达增强从而启动自噬[17]。

Pant等研究证明，用药物抑制肝细胞自噬，可抑制HBV在肝细胞内的复制，在感染HBV的人群中广泛存在着肝细胞自噬增强的现象，但具体机制尚不清楚[24]。

在关于HCV的研究中发现，不同基因型的HCV 感染均能导致自噬小体的数量增加，但自噬相关底物蛋白的降解并未增加，表明细胞中自噬小体与溶酶体结合被阻碍，此现象可能与HCV复制相关[25]。

如抑制与自噬小体形成相关的Beclin1或Atg12蛋白的表达，则可明显抑制HCV 的自我复制，提示自噬可增强HCV在细胞内的复制。

在肝脏疾病中，自噬常具有双向性。

一方面自噬在肝细胞受损时为其供能，起保护作用；但另一方面自噬却能促进HSC的活化、促进肝纤维化发展。

随着对自噬机制及其与肝病的关系的不断探究，自噬很有可能成为肝脏疾病治疗的新方向，针对不同的细胞类型研究自噬调节药物将成为肝病治疗新的靶点。

2.转录调控因子Hif-1靶分子Bnip3参与细胞凋亡与自噬的调节
2.1.Hif-1的结构及其表达的调节
Hif-l（Hypoxia induced factor 1，Hif-l）是细胞缺氧时主要发挥转录调控的因子，能使其下游的许多缺氧反应基因被激活，使细胞在长期缺氧环境中得以存活。

Hif-l由α亚基和β亚基两种亚基组成，只有形成异二聚体时才会被激活。

β亚基含有DNA结合区，在组织和细胞内稳定表达，是结构性亚基；α亚基是Hif-1的活性亚基，受缺氧信号的调控。

Hif-lα在其C末端含有两个重要的结构域：氧依赖降解结构域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD），此结构与Hif-lα蛋白的稳定性和转录活性有关；反式激活结构域（transactivation domain，TAD），精细调节Hif-lα转录水平。

Hif-1表达可受多种因素影响，如低氧、钴、镍等金属及部分抗氧化剂，但其中生理性低氧还是调节Hif-1表达的主要因素。

在正常氧分压条件下，泛素蛋白酶体能很快将细胞内Hif-1α亚基降解，半衰期短至5分钟。

当氧分压降低到1%时，Hif-1α的表达迅速增加，进入细胞核与Hif-1β结合后，和转录共刺激因子CBP/p300形成Hif-1转录复合物，从而激活靶基因转录表达。

体内Hif-1的活性主要通过以下四点调节：①Hif-1 在mRNA水平的调节；②Hif-1蛋白水平的调节；③Hif-1二聚化和DNA结合活性的调节；④Hif-1对靶基因转录活性的调节。

目前研究认为，Hif-1的调控主要发生在蛋白水平，
由2条氧依赖的途径调节：①FIH-1氧依赖性酶（factor-inhibiting Hif-1），可将Hif-1α末端反式激活结构域内第803位天冬氨酸残基羟基化，阻抑Hif-1α与转录共刺激因子CBP/p300结合，从而抑制Hif-1的转录激活功能[26]；②氧依赖性酶脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHDs），PHDs使Hif-1α的第564位和402位的脯氨酸残基羟基化，使Hif-1α亚基的ODDD与肿瘤抑制蛋白（von hippel- 1indau protein，pVHL）结合，募集多种泛素蛋白后组成泛素连接蛋白酶复合体，使Hif-1α亚基泛素化，Hif-1α蛋白稳定性和转录活性降低[27]。

2.2.Hif-1α的靶基因
启动子或增强子内含有一个或多个缺氧反应元件（hypoxia responsive element，HRE）是Hif-1调控靶基因的共同点，HRE核苷酸序列为5’-TACGTG -3’，是Hif-1 的DNA 结合位点[28]。

随着Hif-1靶基因的研究深入，发现多种参与调控红细胞生成、血管生成、能量代谢、胚胎发育、pH调节、细胞迁移和肿瘤侵袭以及细胞凋亡和自噬等多种病理和生理学过程的基因均为Hif-1靶基因。

例如与糖酵解有关的glut-1 （glucose transporter-1，葡萄糖转运体1）、pkm2（pyruvate kinase M2，丙酮酸激酶二型）、pgk-1 （phosphoglycerate kinase 1，磷酸甘油酸激酶-1）、ldha（lactate dehydrogenase A，乳酸脱氢酶A）等基因，与糖原合成有关的gsy1（glycogen synthase，糖原合成酶1）基因，与细胞外基质生成以及肝内组织愈合有关的p4ha1（prolyl 4-hydroxylase subunit alpha-1，脯氨酰4-羟化酶α多肽I）基因，与HSC和肝窦内皮细胞活化有关的vegf（vascular endothelial growth factor，内皮细胞生长因子）基因、与调控细胞内Ca2+钙离子平衡有关的stc1（stanniocalcin 1，斯钙素-1）基因等都已被证实是Hif-1的靶基因[29-31]。

此外，Hif-1的表达还与细胞外泌体的分泌有关[32]。

值得关注的是Hif-1靶基因中有一类基因同时与细胞自噬和凋亡相关，如Bnip3（Bcl-2/adenovirus E1B19- kDa interacting protein 3）和Bnip3L（Bnip3-like），二者均为Bcl-2家族中只含BH3结构域（The Bcl-2 homology domain 3-only，BH3 only）亚家族中的成员。

Bnip3L也被称为NIX，是Bnip3的同源二聚体，被分类为FIH-抑制基因，并且可被N-TAD和C-TAD结构域诱导，在严重缺氧时其表达增加[33-34]。

Sowter等发现敲除细胞株中的pVHL基因，即增加Hif-1α的表达，Bnip3表达也随着显著增多；而恢复pVHL表达时，则抑制Bnip3的表达[35]。

Bellot等也证实依赖Hif-1α调控Bnip3表达是低氧诱导产生自噬的关键[36]。

本课题组曾发现在缺氧诱导处理条件下唯一与自噬相关的基因是bnip3[37]。

2.3.Bnip3的结构
Bnip3属于促细胞凋亡相关蛋白。

Bnip3包括以下主要结构：①TM（C-末端跨膜区）：与Bnip3促进细胞凋亡、形成同源二聚体、介导Bnip3定位到线粒体或内质网等相关；②BH3结构域：参与Bnip3介导的caspase-dependent线粒体凋亡途径；③NH2结构域：也与细胞凋亡相关，可与TM结构域结合形成异二聚体，与Bcl-2或Bcl-XL相互作用促进细胞凋亡[38]；④LIR结构域：LC3-interacting region，与自噬相关蛋白Atg8，即自噬微管相关蛋白轻链3（LC3）相结合[39]。

2.4.Bnip3的定位与细胞凋亡
研究证实Bnip3表达定位于线粒体外膜、内质网膜、核膜等多个亚细胞结构。

正常生理条件下，Bnip3在各种细胞中的表达量很低，某些细胞如神经元不表达。

在缺氧条件下Bnip3表达增加，伴随着从细胞质转移到线粒体膜上，通过TM结构域形成的同源二聚体由膜内的C末端插入线粒体外膜，在线粒体外膜上形成质子通道，胞质内的质子流向线粒体，导致亲环蛋白D依赖性的线粒体膜通透性转变孔（MPTP）开放，导致线粒体膜电位缺失、氧自由基（ROS）产生，线粒体变大、涨破、细胞质形成空泡变性，最终导致细胞凋亡。

这种机制为Bnip3介导的Caspase非依赖型细胞凋亡。

ER可储存Ca2+，当Bnip3位于ER时可使其内储备的Ca2+释放，导致Ca2+转移到线粒体内大量的聚集，MPTP通道开放，并产生大量的ROS、膜电位缺失、线粒体内细胞色素C释放到细胞浆，细胞色素c与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合、形成多聚体，结合并激活caspase-9，继而导致caspase级联反应，激活caspase-3，诱导细胞凋亡，为Caspase依赖型细胞凋亡。

除了以上两种促细胞凋亡的作用方式外，Bnip3还通过TM和NH2结构域结合后形成异二聚体与Bcl-2、Bcl-XL相互作用，激活促凋亡蛋白Bax或Bak，增强线粒体通透性，导致细胞色素c释放，细胞发生Caspase依赖型细胞凋亡[38]。

2.5.Bnip3与自噬
Bnip3不仅能够促进细胞凋亡，很多研究表明，在不同类型的细胞中，Bnip3可通过不同的机制促进自噬。

Bnip3引起自噬的机制可能是：（1）Bnip3和LC3的相互作用：Datang Yu等通过免疫共沉淀发现Bnip3与自噬蛋白LC3蛋白相互作用，并定位于线粒体，形成线粒体- Bnip3 -LC3-自噬体复合物，导致线粒体自噬；同时还发现Bnip3L直接与自噬蛋白LC3、GABARAP结合，使线粒体去极化，将线粒体与自噬小体绑定[40]。

Zhu等发现定位于线粒体外膜上的Bnip3通过LIR与吞噬泡（phagophore）膜上LC3结合可诱导线粒体自噬[41]。

（2）其他途径引起自噬：自噬相关蛋白Beclin1也具有BH3区域，低氧刺激时Bnip3可通过其BH3结构域与Beclin-1竞争性的与Bcl-2或Bcl-XL结合，从而释放Beclin1；游离的Beclin1和多种蛋白形成Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶复合体（Type III phosphatidylinositol-3-kinase complex），通过P13K/AKT途径启动自噬[42]。

（3）Rheb是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路中的上游调控蛋白，而mTOR 激酶是调节细胞生长、增殖、存活和自噬等上游通路的汇合点。

Bnip3的TM结构域可结合哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路中的上游调控蛋白Rheb，引起Rheb减少，mTORC2功能受到抑制，诱导自噬产生[43]。

本课题研究目的
综上，本课题组在前期研究中发现Hif-1与肝星状细胞自噬及其活化的关系密切，进一步通过全基因组表达芯片分析，在缺氧诱导的HSC内筛选出Bnip3这一与自噬相关的蛋白；在本课题中，我们以人肝星状细胞系LX-2和体外培养自然活化的小鼠原代肝星状细胞为模型，进一步探讨Bnip3与肝星状细胞活化和自噬关系，以进一步揭示肝纤维化发生发展的相关机制，寻找逆转肝纤维化的靶点。

二、材料与方法
1．主要实验仪器
仪器名称型号厂家
化学发光凝胶成像系统721BR04434 美国Bio-Rad
倒置荧光显微镜DMI3000B 德国徕卡
激光共聚焦显微镜C2 日本尼康
CO2培养箱CCL-170B-8 新加坡ESCO
酶标仪Infinite 200 pro 瑞士Tecan
实时荧光定量PCR仪CFX96 美国Bio-Rad
-80℃低温冰箱DW-86L388 中国海尔
高速冷冻离心机KDC-140HR 安徽中科中佳
电泳仪DYCZ-MINI4 美国Bio-Rad
高压蒸汽灭菌器YXQ-LS-30SII 上海博讯
超净工作台SW-CJ-1F 苏州安泰
恒温培养振荡器HNY-100 天津欧诺
生物安全柜AC2-4S1 新加坡ECSO
恒温干燥箱GZX-DH-500-S 上海跃进
2．实验材料
2.1 普通级BALB/c小鼠：订自北京鼠来宝生物有限公司，雄性，8-12周龄，重30-40g；
2.2日本血吸虫阳性钉螺：订自湖北省血防所；
2.3人肝星状细胞系LX-2。

2.4 主要实验试剂
试剂名称厂家
DMEM培养基美国Hyclone公司和美国Gibco公司YC-1抑制剂美国MCE
胰酶溶液武汉晶能生物科技有限公司
凝胶制备试剂盒广州锐博生物科技有限公司
CoCl2和LPS 美国Sigma公司
胎牛血清美国Gibco公司
Collagenase IV 货号C5138，美国Sigma公司Pronase E 货号P5147，美国Sigma公司Percoll细胞分离液上海的索莱宝公司
细胞裂解液中国碧云天生物技术有限公司
脱脂奶粉美国Aspen公司
5×蛋白上样缓冲液BIOSHARP公司
PVDF膜瑞士Roche公司
蛋白预染Marker 美国Thermo公司
BCA蛋白定量试剂盒中国碧云天生物技术有限公司
ECL发光试剂盒货号为34095，美国Thermo公司DAPI溶液和4%多聚甲醛武汉谷歌生物科技有限公司
抗淬灭封片液货号CA94010，美国Vector公司Trizol 美国Sigma公司
10×PBS 武汉晶能生物科技有限公司AxyPrep总RNA小量制备试剂盒美国Axygen公司
cDNA逆转录试剂盒货号00678526，美国thermo公司SYBR Green 荧光染料法试剂盒货号17747200，中国罗氏公司
免疫组化试剂盒货号8107，美国的CST公司
2.5抗体
抗体货号厂家
α-SMA ab32575 美国Abcam公司
Bnip3 ab10433 美国Abcam公司
LC-3B 12741 美国CST公司
Hif-1α396655 美国Active motif公司P62 PM045 日本MBL公司GAPDH GB12002 武汉谷歌生物科技公司Bnip3 ab38621 美国Abcam公司GFAP 80788 美国CST公司
HRP标记兔抗鼠IgG GB23303 武汉谷歌生物科技公司HRP标记鼠抗兔IgG GB23301 武汉谷歌生物科技公司Alexa Fluor 488 4408 美国CST公司
Alexa Fluor 555 4413 美国CST公司
2.6试剂配方
1）分离胶
分离胶缓冲液 4.0ml
12%分离胶溶液 4.0ml
改良型硫酸铵溶液60μl
2）浓缩胶
浓缩胶缓冲液 1.0ml
5%浓缩胶溶液 1.0ml
改良型过硫酸铵18μl
1）5×电泳缓冲液配制：
甘氨酸47g Tris bas 7.55g SDS 2.5g 双蒸水0.5L 2）5×转膜缓冲液配制：
甘氨酸Tris bas 双蒸水36g 7.55g 0.5L
3）0.1% PBST配制：
吐温-20 1ml 1×PBS 1L 4）0.1%Triton破膜液的配制：
Triton-100 1×PBS 20μl 20ml
上下摇动混匀，配制成0.1%Triton破膜液。

5）1% BSA封闭液：10ml PBST溶液中加入0.1g BSA，摇晃溶解。

6）100%Percoll ：9份的Percoll原液加1份10×PBS配成。

二、实验方法
1.构建血吸虫感染小鼠肝纤维化模型
将6只雄性BALB/c小鼠随机分为两组，一组正常饲养，另一组通过腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴，给予正常饮食饮水，进行定期检测，观察小鼠情况。

感染第8周时，于无菌条件将小鼠脱颈致死，摘取肝脏，立即置入 4%多聚甲醛内固定后，送至武汉谷歌公司进行石蜡包埋、切片。

2.分离小鼠原代肝星状细胞
1）将BABL/c小鼠眼球放血后，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌状态分离肝脏于无菌培养皿中，剪碎至无组织块，转移至50ml离心管；
2）每2块肝脏加入0.2% Collagenase IV和0.2%Pronase E混合消化液15ml，在恒温培养振荡器中，37℃，250rmp，30min；。