β地中海贫血基因检测荧光PCR熔解曲线法下午专家讲座

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【原理】 PCR技术原理
该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷 酸存在下，依赖于DNA聚合酶酶促合成反应。 DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链 DNA来开启合成，经过一个或两个人工合成寡核 苷酸引物与单链DNA模板中一段互补序列结合， 形成部分双链。在适宜温度和环境下，DNA聚合 酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此 为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条 新DNA互补链。而且这种新链又可成为下次循环 模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时 就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能 将待扩目标基因扩增放大几百万倍。
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荧光PCR熔解曲线法原理
解链曲线（熔解曲线）： 在连续加热使DNA变性过程中以温度对
DNA溶液A260值作图，可得一条“S页
50℃， 95℃， 95℃， 55℃， 76℃，
PCR扩增条件
2min 10min 15s 15s 20s
55cycles
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3.熔解曲线分析 ：
95℃，
1min
35℃，
3min
40-80 ℃（0.4 ℃ /5s）升温
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PCR反应基本成份包含：
模板DNA(待扩增DNA) 引物 4种脱氧核苷酸(dNTPs) DNA聚合酶 适宜缓冲液
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PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤组成： ①模板DNA高温变性：93℃双链DNA解离成为单 链 ②模板DNA与引物低温退火(复性)：引物与模板 DNA单链互补序列配对结合 ③引物适温延伸：合成一条新与模板DNA 链互 补链
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【操作步骤】
1.DNA获取（已准备好了） 2.PCR扩增 ：
反应液A管（做好记号）
5000rpm，2秒
总体积25微升
加入 5ul DNA溶液
反应液B管（做好记号）
5000rpm，2秒
总体积25微升
加入 2.5ul DNA溶液
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【目标】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握荧光PCR熔解曲线法原理及方法，熟悉其应 用
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PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus企业Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立。这项技术可在试管内经数小时反应就将特 定DNA片段扩增数百万倍，这种快速获取大量单 一核酸片段技术在分子生物学研究中含有举足 轻重意义，极大地推进了生命科学研究进展。 它不但是DNA分析最惯用技术，而且在DNA重组 与表示、基 因结构分析和功效检测中含有主要 应用价值。
β-地中海贫血基因检测
（荧光PCR熔解曲线法）
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β地中海贫血是指β链合成受部分或完全抑 制一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故惯用 荧光PCR熔解曲线法确定突变类型。我国各民族 β地贫基因突变情况有一定差异，南方汉族突变 基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ654(C→T)和TATAbox-28(A→G)为主，占85%～ 90% 。
解链温度（Tm）：
DNA解链曲线中吸光度 值到达最大吸光度值50%时 温度称为解链温度，也称 为融解温度。此时DNA分子 中50%双链被解开。
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荧光PCR熔解曲线法原理
野生型与突变型DNA碱基组成不一样，所以 他们Tm值和熔解曲线不一样，经过比较野生型 与突变型DNATm值和熔解曲线，并与标准ΔTm值 对照，能够确定β-基因突变型。