水稻转基因系的分子鉴定方法

水稻转基因系的分子鉴定

1．目的

1．1从T2不同转基因株后代中鉴定得到分离出的纯转基因株、杂合转基因株和非转基因株，为根系和生理学实验提供材料；

1．2鉴定纯转基因株中插入T-DNA的拷贝数和插入方式；

1．3鉴定纯转基因株中插入T-DNA的插入位置。

2．材料

中华11 （CK）

H05系列

石狩白毛（CK）

E10系列

WD17系列

3．主要试剂和配方

3.1 DNA微量提取

微量提取液：

200mM Tris-HCl(pH7.5

250mM NaCl

25mM EDTA

0.5% SDS

酚/氯仿

氯仿

无水乙醇、70%乙醇

TE缓冲液（pH8.0）

10mg/ml RNase

3.2 Htp的PCR鉴定

Taq酶及Buffer 购自Takara公司

dNTPs购自华美公司

3.3 植物DNA大量提取

抽提液： 1.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)

75mmol/L Tris-HCl PH8.0

1M NaCl

15mmol/L EDTA

沉淀液： 1%CTAB

50mmol/L Tris-HCl PH8.0

10mmol/L EDTA

高盐TE: 1mol/L NaCl

10mmol/L Tris-HCl PH8.0

1mmol/L EDTA

3．4 Southern杂交

Southern杂交液（1×）:20×SSC 250 mL

5%SDS 5 mL

10%Sarkosyl 10 mL

ddH2O 735 mL

Blocking Reagent 5 g

洗脱液(1x)：20x SSC 10 mL

5%SDS 40 mL

ddH2O 950 mL

3.5 RNA提取

Trizol: 购自Invitragen公司

10×MOPS: 80mmol/L NaAc

0.2mol/L MOPS

10mmol/L EDTA

加DEPC处理的水定容，调pH值至7.0 RNA上样混合物：0.25%溴酚兰

0.25%二甲苯菁

50％甘油

1 mmol/L EDT A

1.2%甲醛变性胶(100ml)：1.2g grose

73ml DEPC水

10×MOPBuffer 10 mL

2.2M甲醛 6 mL

3.6 RT-PCR

反转录酶SuperscriptIII试剂盒购自Invitragen公司 PCR所用试剂同前。

3.7 Northern分析

Northern杂交液（1×）：20×SSC 25 mL

10%SDS 5 mL

10%Sarkosyl 5 mL

1MTrisHcl(ph7.5) 5ml

ddH2O 10 mL

Blocking Reagent 1 g

甲酰胺 50mL

4．方法

4．1 DNA微量提取

取水稻幼小叶片约5cm长,加液氮研磨后加微量抽提液400ul摇匀，加等体积的酚/氯仿摇匀后放置10分钟，5500rpm常温离心10分钟，取上清液于另一个新管，加400ml 氯仿摇匀放置5分钟，5500rpm常温离心10分钟，取上清液于另一个新管，加2倍体积无水乙醇沉淀5分钟，离心3分钟后弃上清液，70%乙醇洗2次，风干后30ul 0.5XTE溶解，4C保存备用。

4．2 转基因系的PCR鉴定

取适量转化苗DNA进行htp基因的PCR反应，反应总体积为25ul,30个循环，产物于1.3%的琼脂糖凝胶电泳检测，初步鉴定转化苗。

样品：

阴性对照：

阳性对照：

样品：

PCR反应液组成：

引物：0.5uM

dNTP: 100uM

Buffer: 2.5ul

TaqE: 1U

DNA: 20-100ng

ddH2O: add to 25ul

PCR条件：

94。C９４C 58C 72C 72 30 cycles

2m 30s 50s 1m 5m

引物序列：

htpF1: GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG

htpR1: GTCCGTCAGCACA TTGTTGGAG

4．3 插入拷贝数与插入方式的确定

4.3.1 转基因植株DNA的提取（CTAB法提取）

将PCR 鉴定的转基因株分单株取叶片3～5g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉末，倒入50m L离心管中。加入20m L预热到80℃的CTAB提取液摇匀。56℃水浴保温15～20分钟，并经常拿出来摇动几下。加入15m L 氯仿，摇匀后，平放在摇床上剧烈摇动10分钟。室温下3500rpm离心15分钟。移上清液至另一离心管，加入1/10量的10% CTAB，摇匀。加入15m L氯仿，混匀后，在摇床上激烈摇动15分钟。室温下3500rpm离心15分钟，移上清至另一离心管，加入等量的沉淀液，摇匀后放置10～15分钟。将沉淀的絮状物用牙签勾起，倒尽上清并尽可能地把残液吸除（如果沉淀量少，则用3500rpm ，室温下离心10分钟，弃去上清液并用移液器将残液尽可能除去）用吸管头将沉淀扩散到管壁上，加入3～5m L高盐TE和0.05mg RNA酶。在65℃摇床中轻摇至完全溶解。加入2倍体