转基因肿瘤动物模型的研究进展

• 共获得HBx基因阳性动物3只(单独注射组2只，联合注射组1 只)，EGFP基因阳性动物1只(联合注射组)。对活检肝组织进 行常规HE染色和免疫组化检测，显示3只树鼩(E9478、E9242、 E9256)部分肝细胞有HBxAg阳性颗粒分布。两只树鼩(E9260、 E9252)活检肝组织出现EGFP蛋白表达。
• Anthony等（1999）尝试预先将小鼠精子进行破膜 处理，与编码绿色荧光蛋白GFP或B－半乳糖苷酶报 道分子的外源DNA短时间（1min）共孵育，然后徽 注射入减数分裂II期的卵母细胞质中，取得64%—— 94%转基因表达胚胎，并揭示精子与外源DNA在注射 前已结合。将转GFP的胚胎移植，20%的后代表现为 基因整合，此项研究揭示，精子膜经冷冻干燥或解冻 处理后，外源DNA可穿过外膜，吸附于内膜。因此外 源DNA能通过精子的徽注射有效转入卵母细胞 。
• 经膜处理精子胞浆微注射法结合了原核显微注射和精 子载体法各自的长处。
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6.胚胎干细胞法
• 胚胎干细胞（ES细胞）是指囊胚 期的内细胞团中尚未进行分化的 细胞，具有类似癌细胞无限繁殖 和高度分化的潜能。
• 通过段显微注射、逆转录病毒感 染或电穿孔把外源基因导人细胞, 再筛选出基因转化的细胞, 注射人 宿主囊胚, 它们可整合到宿主胚胎, 参与胚胎发育, 最后嵌合到宿主动 物体内的各组织器官中, 形成转基 因嵌合动物。
• 转ras基因小鼠动物模型， K-ras 突变是胰腺癌发生的起始事件， 但单一的K-ras 作用下发生瘤变的潜伏期很长且极少发展为PDAC, 说明肿瘤进展仍需其他的加速基因。
Ijichi等将K-ras突变与Ⅱ型TGFB受体的敲除结合起来，导致小 鼠肿瘤的外显率为100%，且肿瘤病理特征非常接近人类胰腺导 管腺癌
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• 1980年Gordon等首次用显微注射法将外源基因注入小鼠受精卵， 成功获得了转基因小鼠。目前已有多种转基因鼠模型应用于肿瘤 形成的研究。
• 转HBx基因小鼠动物模型，已有研究证实HBx转基因的单独表达 能诱导小鼠肝癌的形成。
• 转HBV超长序列小鼠动物模型，将HBV基因组全长的HBV DNA导 入小鼠受精卵，能建立复制出完整HBV并产生病毒血症的复制型 HBV转基因小鼠，转移的HBV基因能稳定穿代。
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原癌基因的结构改变形式与其表达激活 • （一）点突变
C--ras：12、13、61位密码子点突变，存在于多种肿瘤． • （二）染色体易位
染色体易位（translocation）：是染色体的一部分因断裂脱 离，并与其它染色体联结的重排过程。
因染色体易位造成的原癌基因激活： 1、 因易位使原癌基因与另一基因形成融合基因，产生一个具有 致癌活性的融合蛋白， 如t（9：22）使c-abl与bcr融合，产生一 个致癌的P210蛋白 。 2、 因易位面使原癌基因表达失控，如t（8：14）易位使c-myc 表达失控． • （三）基因扩增 基因扩增（gene amplification）即基因拷贝数增加．如HL-60 和其它白血病细胞，C-myc扩增8-22倍．
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胎细胞毁灭，绝不允许其存活超过14天。
• 从胚胎中提取未经完全发育的干细胞，能培育出各种人体组织，用于治 疗白血病、帕金森氏症、阿尔茨海默病、心脏病和器官衰竭等病症。由
于具有细胞提供者本人的基因特征，因此病人接受移植后不会产生异体
排斥反应，具有很高的医学价值。
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5.胞质内精子微注射介导的转基因
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一.常用的转基因技术。
• 显微注射法 • 逆转录病毒感染法 • 精子载体法 • 体细胞核移植（克隆）法 • 胞质内精子微注射介导 • 胚胎干细胞法
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1.显微注射法
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2.逆转录病毒感染法
• 反转录病毒（Retroviruses）作为转基因载体是目前 应用较成功的一种基因转移方法。
• 利用反转录病毒的LTRs（长末端重复序列）区域具有 转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部 进行重组后，再使之包装成为高滴度病毒颗粒，去直 接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，携带外源基因的反 转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。
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• 原癌基因是细胞的正常基因，其表达产物对细胞的生理功能极其 重要，只有当原癌基因发生结构改变或过度表达时，才有可能导 致细胞癌变。
• 抑癌基因，正常时起抑制细胞增殖和肿瘤发生的作用。许多肿瘤 均发现抑癌基因的两个等位基因缺失或失活，失去细胞增生的阴 性调节因素，从而对肿瘤细胞的转化和异常增生起作用。
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4.体细胞核移植
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• 2007年英国宣布，批准科学家将人类与动物细胞混合起来制造胚胎并用
于医学研究的计划
• 他们的计划是，从特殊病人的皮肤细胞中提取细胞核，植入剔除了细胞 核的牛或兔子的卵细胞中，制造出一个杂交胚胎细胞。该计划的科学家
表示，一旦胚胎细胞混合成功，他们会从中提取干细胞，随后立即把胚
• ES细胞介导法是和基因定位整合
相结合的方法，可克服外源基因
随机整合带来的弊端，而且可在
体外条件下对外源基因的表达进
行筛选。
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二.可用于建立肿瘤动物模型的动物品系。
理想的肿瘤动物模型应具备以下条件： 1.动物模型与人类肿瘤的生物学行为相同或相似。 2.动物易得易养且价格低廉，动物大小、体型、寿命、
繁殖周期等适合所做的实验研究。 3.动物模型构建技术方法简单可行，实验周期适合。 4.动物模型成熟稳定且可重复性好，转基因效率高且
死亡率低。
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目前用于研究的实验动物分为以下几类：
1.啮齿类：大鼠、小鼠、豚鼠、土拨鼠等 2.畜类哺乳动物：兔、狗、牛、羊、猪等 3.禽类：鸡、鸭、鹌鹑等 4.鱼类：斑马鱼、新月鱼、金鱼、罗非鱼等 5.非人灵长类：猩猩、狒狒、猴子、类人猿等 6.其它：树鼩等
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4.发展方向及展望。
众多新技术在肿瘤动物模型中的应用为肿瘤研 究带来了革命性的变化，大量肿瘤动物模型的建立 使我们可以深入研究肿瘤的生物学行为。一个好的 肿瘤动物模型与其模拟的人类肿瘤在分子、组织学 以及生物学特性方面应有许多共性。有鉴于肿瘤的 发生常常是靶细胞基因的改变与微环境的改变进行 性积累并相互作用的结果，肿瘤的发生是多因素综 合作用的结果，而且肿瘤的发生是多步骤多阶段性 的，特别是癌变前期的研究，即在肿瘤形成过程中 癌基因是如何协调作用的？因此综合采用以上多种 方法构建肿瘤动物模型将是今后努力的方向。
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3.精子载体法
• 将受精前的精子适当处理,使其携带上外源目的基因, 在受精时导入卵母细胞,外源目的基因在精子内或早期 胚胎阶段整合进入基因组,最终获得转基因动物。
• 直接注射的方法,将脂质体包裹的含目的基因的重组质 粒注入雄性动物睾丸组织或输精管中,然后与正常雌性 动物自然交配。生产子代动物中获得转基因动物。

• 转基因家兔肿瘤模型已有报道，Knight等制作了携 带EJ-ras基因和兔乳头瘤病毒DNA的转基因家兔。 表达人类原癌基因的转基因家兔模型已被应用于研 究人类肿瘤发生机制、寻找预防和治疗措施。
• 转基因树鼩肿瘤模型，在构建重组质粒pcDNA3.1HBx和pEGFP-N1-Kras的基础上，采用直接注射的 方法，将脂质体包裹的重组质粒注入动物睾丸中， 探讨利用睾丸内生精小管微注射精子载体法建立转 HBx、突变Kras基因树鼩的可行性，为建立转HBx、 突变Kras基因树鼩肝癌动物模型并进一步研究两种 基因在肝细胞癌发生发展过程中的作用打下基础。
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三.已建立的人类肿瘤转基因动物模型。
目前构建转基因肿瘤动物模型主要采取以下途径： 1.直接将癌基因及促进肿瘤发生发展的基因转入到动
物体内，使目的基因在特定组织表达或非特异性表 达。 2.转入肿瘤血管生成调控基因，从基因水平调控肿瘤 血管生成。 3.转入肿瘤转移促进基因，主要是金属基质蛋白酶类 基因。 4.转入肿瘤细胞耐药相关基因。
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• 在构建重组质粒pcDNA3.1-HBx和pEGFP-N1-Kras的基础上， 采用直接注射的方法，将脂质体包裹的重组质粒注入动物睾丸 中，探讨利用睾丸内生精小管微注射精子载体法建立转HBx、 突变Kras基因树鼩的可行性，为建立转HBx、突变Kras基因树 鼩肝癌动物模型并进一步研究两种基因在肝细胞癌发生发展过 程中的作用打下基础。
转基因肿瘤动物模型的研究进展
全世界恶性肿瘤发病率和死亡率均呈增加的趋势
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• 加快肿瘤病因和发病机制的研究以及探索有效的肿瘤 治疗新方法显得尤为重要
• 利用转基因技术建立人类肿瘤疾病的转基因动物模型， 研究外源基因在整体动物中表达的调控规律，从而对 揭示人类肿瘤的病因、发病机制和治疗学研究将会起 到极大的促进作用。