分离作业解析

6.某蛋白质经SDS-PAGE后，测定凝胶长度 为10 cm，指示剂溴酚蓝移动距离为8. 5 cm，待染色、脱色毕，测定出凝胶和蛋白质 谱带的长度分别为11 cm 和5. 5cm，计算 该蛋白质的迁移率(Rf值)。
=(5.5/8.5)× (10/11) =0.588
1、在操作和应用方面，疏水层析与亲和层析、离 子交换层析、凝胶层析相比有哪些异同点？
疏水层析
相同点
离子交换层析
亲和层析
凝胶层析
待分离组分都会吸附到介质上
分 离 原理 不同点 疏水作用的差异 电荷的差异 力
待分离组分不会吸附 到介质上 生 物 亲 和 分子量差异 平衡→上样→洗脱→ 再生 上样体积小，，洗脱 体积大 层析过程只用一种缓 冲液 可以用于纯化，无富 集作用，不适合在纯 化的早期和中期使用。
相同点
操作 平衡→上样→再平衡→洗脱→再生 上样体积大，洗脱体积小
不同点 高盐上样，低盐 低 盐 上 样 ， 高 吸附及洗脱随 洗脱 盐洗脱 亲和原理而异 相同点 可用于富集或纯化，在纯化的各个阶段都可以应 用
应用
不同点 专一性弱，应用 专 一 性 弱 ， 应 专 一 性 强 ， 应 特别适用于单体和寡 广泛性一般 用广泛性弱 用广泛性强 聚体的分离及脱盐。
SDS-PAGE只能用于蛋白质亚基分子量
的测定，因为必须用还原剂把二硫键打开，
蛋白质的肽链才会解聚，其与SDS的结合才
会充分，使肽链形成棒状。
一般的SDS-PAGE指的都是还ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ型 SDS-PAGE。
3、IEF-PAGE、SDS-PAGE的操作程序与普通 PAGE有何差异?
PAGE SDS-PAGE IEF-PAGE
5.配15%聚丙烯酰胺凝胶溶液10 ml，问需 丙烯酰胺和双丙烯酰胺各多少克(C=5%)?
C%=b/ (a+b) ×100%=0.05 ↓ a:b=19:1 T%=(a+b)/m × 100% ↓ 0.15=(a+b)/10 ↓ 1.5=(19b+b)
↓ b=0.075 g，a=19b=1.425 g
1.已知某蛋白质由两条肽链组成，如何用 SDS-PAGE判断它们之间是以共价键连接的?
若二者以共价键（二硫键）方式相连 接，经还原SDS-PAGE后，可显示两条谱带， 通过迁移率与标准分子质量曲线就可求出 两个亚基的分子质量。
另外，通过凝胶层析法来测定该蛋白 质分子质量(是完整蛋白质的分子质量)，其 大小若与SDS-PAGE测定出两个亚基分子质 量的总和相当，则可初步判定某蛋白质上 的两条链是由二硫键之间以共价键相连接。
电泳 阴阳极电极溶液相同，为缓冲液； 电压通常恒定，电泳终止是以指示剂 移动位置而定。 电 极 溶 液 中 不 含 电极溶液中含有 SDS SDS
正极溶液为酸（如HCl）， 阴极溶液为碱（如NaOH）。 电泳开始时，电流比较强， 但随电泳时间的延长而逐 步降低，等样品聚焦完成 后，电流将恒定，并趋向 于零。
用蒸馏水配制，需加入一 定量和适当pH范围的两性 电解质载体 蒸馏水溶解样品，直接上 样，不需要指示剂，样品 液可加在凝胶的任何位置 上（等电点除外）
用缓冲液配制 在分离胶和(或)浓 在分离胶和(或) 凝胶的制备 缩胶中不含SDS 浓缩胶中含有 SDS 都用缓冲液溶解样品，都需要指示 剂，阴极上样 样品的制备 样 品 + 指 示 剂 ， 直 样 品 + 指 示 剂 接上样 +SDS+ 还 原 剂 ， 加热煮沸3min
4.在小烧杯中加人30%浓度的聚丙烯酰胺凝 胶原液(交联剂占0.8%)2.5ml, pH8.9的缓 冲液1. 25ml，蒸馏水6. 25ml以及适量的 引发剂和激活剂，试求该凝胶溶液的聚丙烯 酰胺凝胶浓度(T)和交联度(C)。
T%=(a+b)/m × 100%
=(2.5 × 0.3)/(2.5+1.25+6.25) × 100% =7.5% C%=b/ (a+b) ×100% =(2.5 × 0.008)/(2.5÷0.3) × 100% =2.7%