GST蛋白纯化方法

制备样品：
1、12000rpm离心5min手机细胞，倒上清。

尽量控干cell沉淀。

每100ml培养液的细胞用4ml冰冷的1xGST Bind/Wash Buffer 重悬。

2、在冰浴或盐冰浴中超声波处理样品。

如果样品已不再粘稠即可停止超声。

如果DNA没有剪切好会因为样品粘稠而堵住柱子。

纯化：
1、将树脂浆灌注（其中树脂为50%）。

小型聚丙烯色谱管可以加载2.5ml树脂（柱床体积），用于纯化
12-20mg目的蛋白。

2、当储存缓冲液（20%乙醇）液面降到柱床上沿以下时，用5x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗树脂。

3、待GST Bind/Wash Buffer流到柱床上沿以下时，加入制备好的蛋白抽提液。

收集流穿组分并置于冰上。

4、以10x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗柱，收集流穿组分并置于冰上。

5、以3x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗脱目的蛋白。

收集洗脱组分置于冰上待后续分析。

6、分析洗脱和穿过组分中出现的目的蛋白。

若目的蛋白带的是无功能的GST则无法与树脂结合，纯化。

7、洗脱结束后，用3-5x体积柱床体积的1xGST Bind/Wash Buffer洗涤柱子。

8、再用3-5x柱床体积的ddH2O洗涤柱子。

9、GST凝胶最后保存于2-3x柱床体积的20%乙醇中。

GST纯化所需试剂：
1、10xGST Bind/Wash Buffer（pH7.3）用NaOH或HCl调PH
配制500ml 10xGST Bind/Wash Buffer试剂配方：
43mM 的Na2HPO4.12H2O 需称量7.7g
14.7mM的KH2PO4需称量1g
1.37M NaCl 需称量40.03g
27mM KCl 需称量1g
使用时稀释10x变成1xGST Bind/Wash Buffer即可。

2、1xElution Buffer 配制（现配现用，以免被氧化）
取1g还原型谷胱甘肽溶于3.25ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer中，再加ddH2O稀释到32.5ml。

0.04g 就加1.3ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer 溶于11.7mlddH2O
0.05g 就加1.625ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer 溶于14.625mlddH2O
0.016g 就加0.52ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer 溶于4.68mlddH2O
0.0308g即30.8mg 就加1ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer 溶于9mlddH2O
10xGlutathione Reconstitution Buffer即为（500mM Tris-HCl，pH8.0）
10xPBS（7.2-7.4）配方：
NaCl 需称量78.9g
KCl 需称量1.5g
Na2HPO4.12H2O 需称量35.8g
KH2PO4需称量2.31g
灭菌，室温保存。

使用时稀释成1xPBS，破碎前洗菌体用，有些实验室直接用其替代1xGST Bind/Wash Buffer 纯化蛋白。

His标签蛋白纯化
我们买的His标签中带的说明书上的配方如下：
1、Binding Buffer/Washing Buffer
Tris-HCl（pH7.9）20mM
咪唑10mM
NaCl 0.5M
2、Elution Buffer
Tris-HCl（pH7.9）20mM
咪唑500mM
NaCl 0.5M
1M 咪唑17g/250ml；6.8g/100ml
1M Tris-HCl pH7.9 1L 称量121.1g Tris，加浓HCl调pH。

灭菌后室温保存。

调整pH值需加浓HCl的量
7.4约70ml
7.6 约60ml
8.0 约42ml
配制250ml需称30.275g，加浓HCl的量相应减少；
5M NaCl/1L 292.2g 灭菌后4℃保存。

同学们给我的一个配方如下：暂时别用这个
Binding Buffer/Washing Buffer:
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
20mM咪唑即1.36g 调pH=8.0
Elution Buffer:
50mM NaH2PO4
30mM NaCl，不知道这里是不是写错了，是300mM？
250mM 咪唑即17.00g 调pH=8.0
咪唑的浓度可根据需要调整，一般用500mM的。