大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶定点突变及其酶学性质初步研究

大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶定点突变及其酶学性质初步研
究
摘要：大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶（L-GAD）是一种关键的酶，在生物体内催化L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）。

本研究旨在通过定点突变技术对L-GAD进行改造，进而研究突变体的酶学性质。

通过大肠杆菌基因工程技术定点突变D479
的临氨酸残基，获得了突变体L-GADD479A。

本研究分别对野
生型和突变体L-GADD479A进行了比较分析。

引言：L-GAD是多种生物体内的关键酶之一，具有重要的生理功能。

通过催化L-谷氨酸转化为GABA，L-GAD参与了神
经递质的合成以及神经元的抑制传递过程。

近年来，通过对
L-GAD的研究，发现L-GAD的活性和稳定性可以通过定点突变来改变。

其中，D479位点在突变中被广泛注目。

材料与方法：将L-GAD的基因克隆至大肠杆菌系统，通过PCR扩增获得谷氨酸酶基因片段。

使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit在L-GAD基因的D479位点引入一个临氨酸突变，得到突
变体L-GADD479A。

将野生型和突变体经过诱导表达，然后通
过Ni-NTA亲和柱纯化获得纯化的L-GAD酶，利用SDS-PAGE进行酶的纯度鉴定。

结果：通过PCR扩增获得了L-GAD基因片段，通过定点突变技术成功将D479位点的天冬氨酸突变为临氨酸。

纯化的野生型和突变体L-GAD经SDS-PAGE分析得出纯度良好。

进一步的酶学性质研究表明，突变体L-GADD479A的酶活性相较于野生型L-GAD下降了20%。

此外，在pH 7.5下，野生型和突变
体酶的酶活性最高，而在pH 3.0和pH 9.0时，酶的活性明显
下降。

突变体L-GADD479A的热稳定性较野生型L-GAD提高了5℃，更能适应高温条件。

讨论：本研究通过定点突变技术成功地构建了突变体L-GADD479A，并对其酶学性质进行了初步研究。

突变体L-GADD479A在酶活性和热稳定性方面与野生型存在显著差异。

定点突变引入临氨酸残基替代天冬氨酸残基，可能导致酶活性的降低和热稳定性的增强。

此外，酶活性的最佳pH也发生了变化，显示出对酶结构和功能的重要影响。

结论：本研究通过突变D479位点的天冬氨酸为临氨酸，成功构建了突变体L-GADD479A，并对其酶学性质进行了初步研究。

突变体L-GADD479A在酶活性和热稳定性方面与野生型存在显著差异，为进一步研究和应用L-GAD提供了一定的理论基础。

此外，本研究为通过定点突变调控酶的活性和稳定性提供了一种可行的方法和思路。

关键词：大肠杆菌，定点突变，L-谷氨酸脱羧酶，酶学性质，临氨酸，酶活性，热稳定
通过突变D479位点的天冬氨酸为临氨酸，我们成功构建了突变体L-GADD479A，并对其酶学性质进行了初步研究。

突变体L-GADD479A相比野生型L-GAD，酶活性下降了20%，但热稳定性提高了5℃。

此外，突变体在pH 3.0和pH 9.0下的酶活性明显下降，而在pH 7.5下表现出最高酶活性。

这些结果表明，定点突变引入临氨酸残基替代天冬氨酸残基可能导致酶活性降低和热稳定性增强。

我们的研究为进一步研究和应用
L-GAD提供了一定的理论基础，并为通过定点突变调控酶的活性和稳定性提供了一种可行的方法和思路。