牙龈卟啉单胞菌促进小鼠腹主动脉瘤发展机制的初步探讨

医科大学动物伦理审查批准。 腹主动脉瘤模型制备 ：改良自 Longo 等 [16] 方
法。小鼠 3.6% 水合氯醛 36 mg/kg 腹腔内注射麻醉， 仰卧定位，剃毛、消毒。取下腹部正中切口，长 约 1.5 cm，逐层切开皮肤，肌肉，进入腹腔，将肠 管推向腹腔外，充分暴露并游离出肾动脉水平以下 髂动脉水平以上腹主动脉段约 0.5 cm。腹主动脉周 围组织以棉球分离保护。B 组和 D 组小鼠用浸过 0.25 mmol/L CaCl2 溶液的棉粒在腹主动脉表面涂擦 5 min，浸润 20 min，干棉球吸尽残余 CaCl2 溶液， 生理盐水冲洗干净，关腹缝合。A 组和 C 组小鼠用 0.9%NaCl 溶液同样处理。8 周后处死，取血和剥 离腹主动脉。
组织学观察 : 动脉组织标本 4% 多聚甲醛固定， 石蜡包埋，切片厚度 5 μm，HE 染色和弹力纤维染 色。光镜观察各组血管结构、损伤及炎症细胞浸润 程度，弹力纤维的破坏和降解等 。 [17]
免 疫 组 化 法 检 测 MMP-9 和 S100A9 的 表 达 ： 采用免疫组化 S-P 染色法，5 μm 切片进行抗原修 复和封闭内源性生物素，滴加一抗（MMP-9 1:100； S100A9 1:100），4 ℃过夜，PBS 洗涤 3 次后滴加二 抗，PBS 洗涤，DAB 显色，蒸馏水处理，苏木精 染色，常规梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性 树胶封片，显微镜下观察染色结果，阳性为细胞质、 细胞核上棕黄色沉淀。应用 Image Pro Plus 专业图 像分析系统对免疫组化染色后的病理图像进行定量
【关键词】 牙龈卟啉单胞菌 ；腹主动脉瘤 ；炎症 ；MMP-9 ；S100A9 【中图号】 R378 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-673X(2021)03-0140-06
Plausible mechanism of Porphyromonas gingivalis promoting the development of abdominal aortic aneurysm WANG Dong-qing, REN Shuang, SUN Zheng. Department of VIP Dental Service, Capital Medical University School of Stomatology, Beijing 100050, China
周组织细胞外基质破坏 [5, 6]，牙周治疗后唾液及龈 沟内 MMP 水平明显降低 [7]。
近年来一些流行病学研究显示牙周炎与腹主动 脉瘤可能相关 [8, 9]。前期研究 [10] 成功建立小鼠实验 性腹主动脉瘤和牙周感染的复合模型，发现牙龈卟 啉单胞菌可以促进小鼠实验性腹主动脉瘤的形成和 发展。这些提示牙周致病菌在腹主动脉瘤的发生发 展中有一定的作用。但牙周致病菌通过何种机制影 响腹主动脉瘤的病变过程目前尚不明确。
细菌注射 : 螺旋管埋入 3 周后 ,C 组和 D 组小 鼠皮下螺旋管内注射 Pg 菌液 0.1 ml，每周 1 次， 共 7 次。A 组和 C 组用 PBS 同样处理。实验流程 见图 1。
图 1 实验流程
主动脉瘤外径的测量 ：在腹主动脉瘤制模术前 及术后 8 周，游离肾动脉水平以下髂动脉水平以上 腹主动脉，显微镜配置摄像头拍照，以标尺参照， 使用 OPT Pro 数码显微图像分析处理软件测量血管 直径。取 20 个不同横截面进行测量，最后求得最 大直径进行统计学分析。
材料和方法
1. 实验试剂和器械 弹 力 纤 维 EVG 染 色 套 装 ( 福 州 迈 新 公 司 产 品 ) ；兔源 MMP-9 多克隆抗体（1.0 mg/ml）、鼠源 S100A9 单克隆抗体（1.0 mg/ml，Abcam，英国）； MMP-9 ELISA 试 剂 盒、S100A9 ELISA 试 剂 盒、 IL-6 ELISA 试剂盒（北京基普生物科技有限公司）； SZ660 B2L 体视显微镜（重庆奥特公司）；OPTPro 显微图像采集分析系统 ；CaCl2 粉剂 ( 北京化工厂 试剂 ) ；CDC 固体和液体培养基 ( 自制 )。 2. 实验动物 SPF 级 C57BL/6 小鼠（雄性，6~8 周，18~20 g）， 购于北京维通利华实验动物技术有限公司。 3. 实验方法 细菌培养 ：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）33277 来自北京口腔医学研究所。 CDC 固体培养基培养 Pg ATCC 33277，挑取菌 落传至 CDC 液体培养基中培养 3 代。收集菌液， 调整注射浓度为 108 CFU/ml。CDC 固体培养基（培 养皿）培养 5 天，液体（培养管）培养 2 天。 小鼠皮下螺旋管包埋 ：将直径 0.5 mm 的镍 铬矫正线缠绕成金属螺旋管 ( 长度 10 mm, 直径 5 mm), 在 3.6% 水合氯醛 (0.01 ml/g) 腹腔注射麻醉下 , 包埋入全部小鼠的背部皮下。 小鼠随机分为 4 组 ：① A 组 ：10 只，腹主动 脉 NaCl 处理 + 皮下螺旋管内磷酸盐缓冲液（PBS） 注射 ；② B 组 ：12 只，腹主动脉 CaCl2 溶液处理 + 皮下螺旋管内 PBS 注射 ；③ C 组 ：12 只，腹主动 脉 NaCl 溶液处理 + 皮下螺旋管内 Pg 注射 ；④ D 组 ：12 只，腹主动脉 CaCl2 溶液处理 + 皮下螺旋管 内 Pg 注射。标准鼠饲料由北京口腔医院动物实验 中心提供，恒温恒湿，自由饮食。本研究获得首都
【Key words】 Porportic aneurysm; Inflammation; MMP-9; S100A9
腹 主 动 脉 瘤 (abdominal aortic aneurysms, AAA) 是一种以腹主动脉局限性扩张为主的病死率极高的 血管疾病。65 岁以上男性平均发病率在 5% 左右 [1]。 感染和炎症被认为在腹主动脉瘤发生、发展过程 中起着关键作用 [2, 3]。在人类动脉瘤组织标本中观 察 到 基 质 金 属 蛋 白 酶（matrix metallo-proteinases， MMPs）的表达增加 [4]。而在牙周疾病，基质金属 蛋白酶也扮演关键的角色，牙周致病菌产生宿主免 疫炎性反应，分泌细胞因子和 MMPs，最终导致牙
Hokamura 等 [11, 12] 研究显示口腔感染牙龈卟啉 单胞菌的心血管疾病患者的病变区 S100A9 表达升 高，并且小鼠损伤血管给予牙龈卟啉单胞菌感染 后，S100A9 在炎性和平滑肌细胞中持久高表达。 S100A9 蛋 白（CalgranulinB 蛋 白、MRP14 蛋 白 ）
北京口腔医学 2021年第29卷第3期 Beijing Journal of Stomatology June 2021，Vol. 29，No. 3
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北京口腔医学 2021年第29卷第3期 Beijing Journal of Stomatology June 2021，Vol. 29，No. 3
牙龈卟啉单胞菌促进小鼠腹主动脉瘤发展机制 的初步探讨
王冬青 任爽 孙正
【摘要】 目的 利用牙周致病菌皮下感染和腹主动脉瘤复合动物模型探讨牙周致病菌影响小鼠腹主动脉瘤 发展的可能分子机制。方法 选择 6~8 周龄雄性 C57BL/ 6 小鼠，皮下金属螺旋管植入 2 周后，CaCl2 涂抹法制备 腹主动脉瘤模型，3 周后在螺旋管内注射牙龈卟啉单胞菌（Pg）构建牙周致病菌感染模型，模型制备 8 周末处 死取血和腹主动脉。腹主动脉行 HE 染色和弹力纤维染色进行病理分析。免疫组化染色观察 MMP-9、S100A9 在 腹主动脉的表达。酶联免疫吸附法检测血循环中 IL-6、MMP-9 和 S100A9 的水平。结果 CaCl2 处理 8 周末，Pg 感染组小鼠的腹主动脉扩张率显著大于未感染组（P ＜ 0.01）。Pg 感染组小鼠腹主动脉 MMP-9（P ＜ 0.01）和 S100A9（P ＜ 0.05）的表达显著高于未感染组。血循环中 IL-6、MMP-9、S100A9 水平较未感染组有升高趋势。 结论 牙龈卟啉单胞菌可能通过上调 S100A9、MMP-9 的表达来促进腹主动脉炎症，降解弹力纤维，导致动脉的 扩张。
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属于钙结合蛋白 S100 家族成员，常和 S100A8 蛋 白（CalgranulinA 蛋白、MRP8 蛋白）形成异二聚 体 S100A8/A9 蛋白复合物 。 [13] 研究显示高水平的 S100A8/A9 是炎症的特征，并且作为趋化分子，由 中性粒细胞、活性单核细胞和巨噬细胞持续表达， 为慢性炎症中多种过程的重要调节者 [14, 15]。本研究 目的在于利用牙周致病菌皮下感染和腹主动脉瘤复 合动物模型探讨 MMP-9、S100A9 在牙周致病菌影 响小鼠腹主动脉瘤发展中的作用。
基金项目 ：国家自然科学基金 (30901678) ；北京市科技新星 项目（2009B41）
作者单位 ：100050 北京 首都医科大学口腔医学院特诊特需科 （王冬青），口腔黏膜科（任爽、孙正）
通讯作者 ：王 冬 青，E-mail ：wdqoral@， 电 话 ： 010-57099272
【Abstract】 Objective To investigate the plausible mechanism how Porphyromonas gingivalis (Pg) affects the progression of experimental abdominal aortic aneurysm (AAA) in a murine model. Methods AAA was produced in C57BL/6 mice by the periaortic application of CaCl2 with NaCl as a control. The mice were inoculated once weekly with live Pg or vehicle. Eight weeks after the CaCl2 / NaCl application, the aortic tissues were harvested for immunohistochemistry and serum samples were taken for measuring the levels of IL-6, MMP-9 and S100A9 by ELISA. Results Eight weeks after the periaortic application of either CaCl2 or NaCl, a significant increase was observed in the aortic diameter in the CaCl2 treatment groups, especially in the combined Pg-challenged mice. The tissue expressions of MMP-9 (P ＜ 0.01) and S100A9 (P ＜ 0.05)elevated in mice with Pg challenge than those in mice with PBS. The circulating levels of MMP-9, S100A9 and IL-6 also increased in Pg-challenged mice. Conclusions Pg may increase the expression of MMP-9 and S100A9 in mice to promote inflammation of abdominal aorta and degrade elastic fiber, leading to the expansion of aorta.