茶多酚对壬基酚所致斑马鱼急性死亡和遗传损伤的保护作用

茶多酚对壬基酚所致斑马鱼急性死亡和遗传损伤的保护作用陈建华;谢艳颖;陈世红;李丹佩
【摘要】为研究壬基酚(NP)对斑马鱼(Danio rerio)的急性毒性和遗传损伤的影响,同时为探讨茶多酚对NP的急性致死和遗传损伤的保护作用,开展了急性毒性实验,分析NP对斑马鱼的半致死浓度,并通过统计斑马鱼外周血细胞中微核率和核异常率来评估NP对斑马鱼的遗传损伤,在NP基础液中加入茶多酚进行斑马鱼的急性毒性保护实验,通过与NP对照组中斑马鱼的死亡情况、微核率和核异常率的对比来评价茶多酚对急性致死和遗传损伤的保护作用.结果显示:高质量浓度的
NP(500.00、1 000.00μg/L)对斑马鱼具有较强的致死性,中、低质量浓度的
NP(125.00、250.00 μg/L)对斑马鱼具有一定的致死能力,此浓度范围内存活的斑马鱼外周血红细胞中存在比清水对照组显著增多的微核和异常核.在NP基础液中加入一定质量浓度(2.50～20.00 ng/L)的茶多酚后,与NP对照组相比,斑马鱼的死亡率显著降低,同时,斑马鱼的微核率和核异常率也都显著降低.这表明一定浓度的茶多酚对NP的急性致死和遗传损伤具有明显的保护作用.
【期刊名称】《环境污染与防治》
【年(卷),期】2018(040)010
【总页数】6页(P1126-1131)
【关键词】壬基酚;斑马鱼;急性毒性;遗传损伤;茶多酚;保护
【作者】陈建华;谢艳颖;陈世红;李丹佩
【作者单位】福建师范大学生命科学学院,福建福州350117;福建师范大学生命科
学学院,福建福州350117;福建师范大学生命科学学院,福建福州350117;福建师范
大学生命科学学院,福建福州350117
【正文语种】中文
壬基酚(NP)是一种环境雌激素，是商用第二大类非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙
烯醚的降解产物，随生产废水和生活污水进入水环境[1],[2]1373,[3-4]。

目前在太湖、嘉陵江重庆流域、长江、珠江三角洲等多条水系中都检测到NP的存在[5-6]。

传统的自来水处理方式仅能除去水中60%左右的NP，同时，NP具有高度疏水性，没有完全转化的NP在水体淤泥中累积时间可长达400 d。

目前发现NP污染范围正逐渐扩大，水产品的养殖用水、池塘甚至人们的饮用水中也逐渐出现了NP，资料显示，上海某郊区的养殖用水、水产品以及上海、广州和重庆的自来水中都检测到了NP[7-11]。

即使水体中NP的含量不高，不会对水中微型生物产生急性毒性
作用，但痕量的NP也会在水生生物体内高度富集，最终通过食物链进入人体，从而对人体健康造成严重的影响。

目前在常食深海鱼油的妇女乳汁和性早熟患儿血清中都检测到了NP。

NP通过染毒水产鱼类、降低其品质进而危害人类健康的风险
客观存在。

现已明确NP在体内的基本作用机制是通过与体内雌二醇竞争结合雌激素受体，通过干扰机体内分泌系统而发挥毒性作用[12]。

如果中断NP与雌激素受体的结合就有可能改善由NP所致的毒性。

茶多酚是从绿茶中提取的多羟基酚类化合物，主要包括黄酮类、酚酸类、黄烷醇类(主要为儿茶素)和黄烷双醇类4大类物质[13]113。

茶多酚不仅可以清除自由基、
抗氧化、防癌抗癌、拮抗外源污染物对机体的损伤，同时，它还能拮抗化学物质对肝、肾的损伤并保护机体免受化学物质的致畸[14-16]。

因此，茶多酚具有强大的
解毒功能。

研究显示茶多酚能减少哺乳动物体内雌激素与受体的结合[17-19]，表明茶多酚具有减少环境雌激素NP与雌激素受体结合的能力，从而缓解由NP引发的毒性作用。

为此，本实验利用模式动物斑马鱼(Danio rerio)为实验材料，研究NP对斑马鱼的急性毒性和遗传损伤的影响，同时探讨了茶多酚对NP的急性致死和遗传损伤的保护作用。

1 材料与方法
1.1 材料
斑马鱼购自福州国艺花鸟市场，鱼体平均体长为(3.0±0.5) cm，平均体重为(4.0±0.5) g，驯养7 d后选择健康、游动灵活、反应敏捷、体表正常的斑马鱼进行实验。

实验水质主要参数为：水温(20±2) ℃，pH 7.5～7.8。

NP购自南京某生物科技有限公司，NP用无水乙醇助溶，配制成250 g/L NP用液。

茶多酚购自天津某生化科技有限公司。

1.2 NP的急性毒性实验
采用半静水实验法进行急性毒性实验。

实验设置清水对照组、乙醇对照组以及不同浓度的NP染毒组，实验用水均为预先曝气48 h的自来水，按浓度倍比稀释的方法将NP稀释成质量浓度为 125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/L的溶液。

每组投放10尾斑马鱼。

实验开始前24 h停止喂食，实验期间不喂食，每隔24 h 更换一次实验用水。

48 h内观察斑马鱼的中毒症状并计数死亡鱼数。

以玻璃棒轻触鱼的尾部，没有反应视为死亡。

采用寇氏法计算24、48 h半致死浓度(LC50)和95%置信限[20]。

寇氏法的计算公式为：
C=lg-1[Xm-i×(∑D-0.5)]
(1)
式中：C为LC50，μg/L ；Xm为NP最大浓度的对数值；i为相邻两组NP浓度对数的差值；D为各组斑马鱼死亡率，%。

LC50的标准误(SE，μg/L)、LC50的95%置信上限(θu，μg/L)、LC50的95%置信下限(θd，μg/L)计算方法为：
(2)
θu =lg-1(lgC+1.96×SE)
(3)
θd =lg-1(lgC-1.96×SE)
(4)
式中：n为各组斑马鱼尾数。

根据《化学农药环境安全评价试验准则第12部分：鱼类急性毒性试验》(GB/T 31270.12—2014)，参照鱼类48 h急性毒性等级划分的标准对NP毒性进行评估。

剧毒农药：LC50≤0.10 mg/L；高毒农药：0.10 mg/L<LC50≤1.00 m g/L；中毒
农药：1.00 mg/L<LC50≤10.00 mg/L；低毒农药：LC50>10.00 mg/L。

NP对
斑马鱼的安全浓度(Sc，μg/L)参照文献[5]中公式求得。

1.3 血涂片的制备和观察
随机从各组取出5条存活的斑马鱼，断尾取血，每尾斑马鱼制作2片血涂片，自
然晾干，甲醇固定10 min，吉萨姆染色液染色20 min，洗去多余的染色液，自
然晾干后于光学显微镜下镜检，每张血涂片随机观察2 000个左右细胞，观察到
的微核细胞数占观察到的细胞总数的比例，即为微核率，观察到的核异常细胞数(除微核外) 占观察到的细胞总数的比例，即为核异常率。

1.4 茶多酚对急性致死和遗传损伤的保护作用
采用半静水实验法进行茶多酚的保护实验，实验设置NP对照组(茶多酚质量浓度
为0 ng/L)和不同浓度的茶多酚实验组。

根据求得的48 h LC50的95%置信限结果，选取高于95%置信上限的NP浓度为NP对照组浓度进行急性致死毒性的保
护实验，选取低于95%置信下限的NP浓度为NP对照组浓度进行遗传损伤的保
护实验，在此浓度的NP中加入茶多酚作为实验组，按倍比稀释的方法设置4个
茶多酚实验组，茶多酚质量浓度分别为2.50、5.00、10.00、20.00 ng/L。

每组投放10尾斑马鱼，在水温(20±2) ℃下饲养48 h。

急性毒性保护实验按照1.2节的
实验方法进行，观察斑马鱼的中毒症状、计数死亡鱼数。

遗传损伤保护实验按照1.3节的实验方法对实验48 h的斑马鱼微核率和核异常率进行观察与计数。

1.5 数据统计
运用SPSS 11.0系统软件将获得资料进行单因素方差分析，采用线性回归分析茶
多酚浓度和保护效应之间的关系，用相关系数来表示相关程度。

P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论
2.1 茶多酚对NP所致斑马鱼急性死亡的影响
2.1.1 NP对斑马鱼的急性致死效应及其安全性评价
斑马鱼在清水对照组和乙醇对照组中生活状态良好，无死亡情况出现。

不同浓度NP下斑马鱼的死亡情况见图1，NP对斑马鱼的急性毒性数据见表1。

斑马鱼在
低质量浓度NP(125.00 μg/L)中可以生存48 h，生活状态与清水对照组无显著性
差别；48 h内，中质量浓度NP(250.00、500.00 μg/L)对斑马鱼具有一定的致死效应，其致死率与NP浓度及染毒时间呈正比；高质量浓度的NP(1 000.00 μg/L)对斑马鱼具有极强的致死能力，24 h可致斑马鱼全部死亡。

NP的48 h LC50为332.00 μg/L,介于0.10～1.00 mg/L，按照划分标准，NP对斑马鱼的毒性已达到高毒农药水平，对水生生物具有较强的毒性作用，经计算可知，NP对斑马鱼的安全浓度为37.00 μg/L。

资料显示低等水生生物对NP敏感，能造成NP在水生生物体内的蓄积，某些藻类富集的NP含量可以达到水体NP含量的1 000倍，而鱼类对NP的富集也可高达
400倍[21-23]。

所以即使水体中的NP含量不高，也会在水生生物体内高度富集，最终通过食物链扩大NP的浓度并最终进入人体，从而对人体健康造成严重的影响。

本实验结果中显示NP的48 h LC50为332.00 μg/L，与黄长江等[24]研究NP对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×Oreochromis aureus)48 h LC50为
351.50 μg/L的结果接近。

一项对我国京杭大运河NP含量进行调查研究的资料表明：某NP生产厂废水排放口下游河段的NP高达42.00 μg/L[2]1372，已超过本实验研究的48 h安全浓度37.00 μg/L。

NP带来的水生态风险客观存在。

图1 NP对斑马鱼的急性致死效应Fig.1 Acute lethal toxicity of NP on Danio rerio
2.1.2 茶多酚对NP所致斑马鱼急性死亡的保护作用
根据急性毒性实验结果，本研究选取高于48 h LC50 95%置信上限的NP质量浓
度(500.00 μg/L)，在此基础上加入不同浓度的茶多酚进行NP急性致死的保护实
验(对照组未添加茶多酚)，结果如图2所示。

随着茶多酚浓度的升高，斑马鱼的死亡率明显降低，表明一定质量浓度的茶多酚(2.50～20.00 ng/L)对NP的急性致死毒性具有明显的保护作用。

本实验预实验发现茶多酚浓度过高(200.00～1 000.00 ng/L)时，斑马鱼出现“浮头”等明显的急性缺氧症状。

这表明仅一定浓度范围的茶多酚对NP的急性致死毒性具有保护作用。

表1 NP对斑马鱼的急性毒性Table 1 Acute toxicity of NP to Danio rerio
注：X为NP质量浓度，μg/L。

图2 茶多酚对NP所致斑马鱼急性死亡的保护效果Fig.2 Protection of tea polyphenol on acute lethal toxicity induced by NP on Danio rerio
图3 斑马鱼暴露于NP中48 h的外周血红细胞形态分类Fig.3 Morphological classification of peripheral red blood cells in Danio rerio exposed to NP 48 h
2.2 茶多酚对NP所致斑马鱼遗传损伤的影响
2.2.1 NP对斑马鱼外周血红细胞形态的影响
正常斑马鱼外周血红细胞形态多为椭圆形，少数为圆形。

正常红细胞表面光滑，细胞膜清晰可见，经吉姆萨染液染色后，细胞质为淡蓝色；细胞核为紫红色，位于细胞的中央，呈椭圆形，与细胞质界限清晰(见图3(a))。

在正常斑马鱼外周血红细胞中，偶见细胞质中存在紫红色的微核，大小小于细胞核的1/3，多数为圆形(见图3(b)、图3(c))。

经NP作用以后，具有微核的外周血红细胞数明显增多。

同时细胞核异常数量明显增多。

核异常包括无核(见图3(d))、核质内凹(见图3(e))、核位异常(见图3(f))、核内空泡(见图3(g))、核质外凸(见图3(h))。

2.2.2 NP诱变下斑马鱼外周血红细胞微核率及核异常的产生
用不同浓度的NP对斑马鱼处理48 h后，清水对照组、乙醇对照组以及NP诱变组中都能够找到微核与异常核。

但清水对照组和乙醇对照组中斑马鱼外周血红细胞微核率和核异常率都较低，而NP(125.00、250.00 μg/L)诱变后，与清水对照组相比，斑马鱼外周血红细胞中的微核率和核异常率都随着NP浓度的增加而显著地升高(见图4、图5)。

注：**表示P<0.01，图5至图7同。

图4 NP对斑马鱼外周血红细胞微核率的影响Fig.4 Effects of NP on the frequency of micronuclei of peripheral red blood cells in Danio rerio
图5 NP对斑马鱼外周血红细胞核异常率的影响Fig.5 Effects of NP on the frequency of nuclear anomalies of peripheral red blood cells in Danio rerio NP作用于鱼类后，产生大量的活性氧，氧自由基的形成将进一步引发脱氧核糖核酸(DNA)的断裂，并对鱼体的DNA造成损伤，产生畸变的染色体[25-28]。

畸变的染色体最终以微核的形式排放到细胞质中。

化学污染物不仅能诱发DNA断裂、染色体畸变、产生微核，同时也影响了细胞正常的有丝分裂，形成了无核、核质内
凹、核位异常、核内空泡、核质外凸等各种细胞核的畸变。

有学者认为核质外凸是微核形成的初期结构[29-30]，而在本研究中也观察到了核质外凸的核异常中有细
丝存在于微核与主核之间，提示了微核与细胞核异常存在着一定的联系。

本实验的结果中发现NP急性毒性实验中存活的斑马鱼外周血红细胞中微核率和核异常率都随着NP浓度的升高而增加，反映了NP对急性毒性中存活的斑马鱼具有遗传损伤作用。

2.2.3 茶多酚对NP所致斑马鱼外周血红细胞微核率及核异常率的影响
根据急性毒性实验结果，本研究选取低于48 h LC50 95%置信上限的NP质量浓
度(250.00 μg/L)为NP对照组，在此基础上加入不同浓度的茶多酚进行NP遗传
损伤的保护实验(对照组未添加茶多酚)。

结果表明，2.50～20.00 ng/L的茶多酚都能显著降低斑马鱼外周血红细胞微核和核异常的产生(见图6、图7)。

以微核率和
核异常率为因变量(Y，%)，茶多酚的质量浓度为自变量(X，ng/L)，分别对茶多酚保护48 h的微核率和核异常率结果进行回归分析，发现斑马鱼外周血红细胞中的微核率和核异常率都随着茶多酚浓度的升高而降低，呈现明显的剂量—效应关系，其微核率—茶多酚浓度的回归方程式为：Y=6.75-1.11X，相关系数为0.98；核异常率—茶多酚浓度的回归方程式为：Y=45.01-7.48X,相关系数为0.99，相关关系经统计学检验都具有显著意义(P<0.05)。

可见，茶多酚对NP诱导的斑马鱼遗传损伤具有一定的保护作用。

图6 茶多酚对NP诱发微核率的影响Fig.6 Effects of tea polyphenol on the frequency of micronuclei induced by NP
图7 茶多酚对NP诱发核异常率的影响Fig.7 Effects of tea polyphenol on the frequency of nuclear anomalies induced by NP
本实验利用NP基础液中添加茶多酚的方法对茶多酚的保护作用进行了研究，发现茶多酚组中斑马鱼的死亡率明显降低，提示茶多酚能保护斑马鱼免受NP的急性致
死作用，同时茶多酚组斑马鱼外周血细胞中的微核率和核异常率也比NP对照组中明显降低，说明茶多酚的存在降低了NP诱发的遗传损伤风险。

综合以上结果，在水产养殖中添加适当的茶多酚将能保护斑马鱼免受NP的急性致死毒性和遗传损伤毒性影响。

茶多酚做为一种天然优质的抗氧化剂，在多种水产品的养殖中受到关注。

有资料显示添加一定量的茶多酚能显著提高团头鲂(Megalobrama amblycephala)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等多种水产品的增重率和特定生长率，同时能改善水产品肉质，提高肌肉中的粗蛋白含量
[13]114,[31]100, [32]549。

此外，龙萌等[31]101发现添加一定量的茶多酚可以增强团头鲂的抗病原菌感染能力，徐奇友等[32]550发现添加一定量的茶多酚可改善虹鳟的非特异性免疫能力，宋传奎等[33]发现添加一定量的茶多酚对苯并[a]芘致青鳉鱼(Oryzias latipes)后代发育畸形具有拮抗作用，表明在水产养殖过程中添加一定量的茶多酚以抵抗养殖用水中NP污染对水产品的毒害作用是可行的。

3 结论
(1) 高质量浓度的NP(500.00、1 000.00 μg/L)对斑马鱼具有较强的致死性；中质量浓度的NP(250.00 μg/L)对斑马鱼具有一定的致死能力；低质量浓度
NP(125.00 μg/L)对斑马鱼无致死能力。

NP对斑马鱼的致死率与NP浓度、染毒时间呈正比。

NP对斑马鱼的安全浓度为37.00 μg/L。

(2) 一定质量浓度的茶多酚(2.50～20.00 ng/L)对NP的急性致死毒性具有明显的保护作用。

(3) 中、低质量浓度的NP(125.00、250.00 μg/L)中存活的斑马鱼外周血红细胞中存在比清水对照组和乙醇对照组显著增多的微核和异常核。

微核和异常核的增加与NP浓度的增加呈正相关。

(4) 在NP基础液中加入一定质量浓度(2.50～20.00 ng/L)的茶多酚后能显著降低
由NP引发的微核和异常核的数量。

参考文献:
【相关文献】
[1] ESPEJO R,VALTER K,SIMONA M,et al.Determination of nineteen 4-alkylphenol endocrine disrupters in Geneva municipal sewage wastewater[J].Journal of Chromatography A,2002,976(1/2):335-343.
[2] 范奇元，金泰，将学之，等．我国部分地区环境中壬基酚的检测[J].中国公共卫生，2002，
18(11)．
[3] 郝瑞霞，周玉文，姚宁，等．再生水中壬基酚健康风险评价[J].环境与健康杂志，2007，24(5)：301-303．
[4] 郝瑞霞，万宏文，张毅，等．再生水用于河湖补水壬基酚环境风险评价[J].北京工业大学学报，2008，34(6)：626-630．
[5] 段菁春,陈兵．洪季珠江三角洲水系烷基酚污染状况研究[J].环境化学，2004，25(3)：48-52．
[6] 刘文萍，石晓勇，王晓波，等．北黄海辽宁近岸水环境中壬基酚污染状况调查及生态风险评估[J].海洋环境科学，2009，28(6)：664-667．
[7] 邵兵，胡建英，杨敏．重庆流域嘉陵江和长江水环境中壬基酚污染状况调查[J].环境科学学报，2002，22(1)：12-16．
[8] 李明姝，刘征涛，周俊丽．内分泌干扰物壬基酚在环境中迁移转化的研究进展[J].环境化学，2013，32(7)：1212-1217．
[9] AMIRIDOU D,VOUTSA D.Alkylphenols and phthalates in bottled waters[J].Journal of Hazardous Materials,2011,185(1):281-286.
[10] 乔丽丽，蔡德培，申建伟，等．某市郊区养殖池塘水产品及底泥中环境内分泌干扰物的调查[J].环境与健康杂志，2010，27(5)：439-440．
[11] 俞捷，吴芹，张镖，等．壬基酚对机体的毒性影响及其机制[J].环境卫生学杂志，2013，3(3)：268-272．
[12] 朱建林，陈昱，李昱辰，等．大豆异黄酮对壬基酚所致大鼠血清性激素紊乱及前列腺增生的改善作用[J].福建医科大学学报，2012，46(4)：231-234．
[13] 刘振兴，柯浩，郝乐，等．茶多酚对罗非鱼生长性能、抗氧化功能和非特异免疫指标的影响[J].广东农业科学，2012，39(23)．
[14] REHMAN H,KRISHNASAMY Y,HAQUE K,et al.Green tea polyphenols stimulate mitochondrial biogenesis and improve renal function after chronic cyclosporin a
treatment in rats[J].PLOS One,2014,8(6):e65029.
[15] OZ H S,CHEN T S.Green-tea polyphenols downregulate cyclooxygenase and Bcl-2 activity in acetaminophen-induced hepatotoxicity[J].Digestive Diseases and
Sciences,2008,53(11):2980-2988.
[16] CHEN X,SUN C K,HAN G Z,et al.Protective effect of tea polyphenols against paracetamol-induced hepatotoxicity in mice is significantly correlated with cytochrome
P450 suppression[J].World Journal of Gastroenterology,2009,15(15):1829-1835.
[17] KAO Y H,HIIPAKKA R A,LIAO S.Modulation of endocrine systems and food intake by green tea epigallocatechin gallate[J].Endocrinology,2000,141(3):980-987.
[18] WU A H,ARAKAWA K,STANCZYK F Z,et al.Tea and circulating estrogen levels in postmenopausal Chinese women in Singapore[J].Carcinogenesis,2005,26(5):976-980. [19] FUHRMAN B J,PFEIFFER R M,WU A H,et al. Green tea intake is associated with urinary estrogen profiles in Japanese-American women[J].Nutrition Journal,2013,12:25.
[20] 陈建华，李智，周志华．维生素C对草甘膦诱发的斑马鱼外周血红细胞微核及核异常的缓解
作用[J].淡水渔业，2013，43(6)：45-50．
[21] 戴媛媛，牛海凤，董玉波，等．壬基酚对水生生物的毒性研究进展[J].环境与健康杂志，2012，29(10)：948-951．
[22] 江敏，彭自然，安世杰，等．4-壬基酚对三种水生生物的毒性影响[J].水生生物学报，2006，30(4)：489-492．
[23] 李正炎，LI D H．西瓦湖中壬基酚和双酚A的污染特征[J].青岛海洋大学学报(自然科学版)，2003，33(6)：847-853．
[24] 黄长江，董巧香，马茹飞．壬基酚对奥尼罗非鱼(Oreochromis n iloticus×O.aureus)的急性
毒性研究[J].海洋与湖沼，2006，37(4)：309-315．
[25] 胡双庆，李延，王珺，等．壬基酚对鲫鱼(Carassius auratus)巨噬细胞的免疫毒性[J].南京大
学学报(自然科学版)，2004，40(3)：341-348．
[26] HILLA J,TERAOKA H,HEIDEMAN W,et al.Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity[J].Toxicological Sciences,2005,86(1):6-19.
[27] 武焕阳，丁诗华，唐毅，等．硫丹对草鱼外周血红细胞微核及核异常的影响[J].淡水渔业，2011，41(5)：28-34．
[28] 杜峰涛，李林．细胞微核形成机理探讨[J].现代检验医学杂志，2007，22(4)：19-22．
[29] 楼允东，吴萍．亚硝基胍对泥鳅红细胞微核及核异常的诱发[J].中国环境科学，1996，16(4)：275-278．
[30] SHIMIZU N,SHIMURA T,TANAKA T.Selective elimination of acentric double minutes from cancer cells through the extrusion of micronuclei[J].Mutation
Research,2000,448(1):81-90.
[31] 龙萌，侯杰，苏玉晶，等．酵母硒和茶多酚对团头鲂幼鱼生长和生长轴基因表达、营养品质及抗病力的影响[J].水产学报，2015，39(1)．
[32] 徐奇友，李婵，许红，等．茶多酚对虹鳟生长性能、生化指标和非特异性免疫指标的影响[J].动物营养学报，2008，20(5)．
[33] 宋传奎,肖斌,王艳丽,等.茶多酚对苯并[a]芘致青鳉鱼后代发育畸形的拮抗作用[J].茶叶科
学,2011,31(3):255-263.。