载银纳米二氧化钛树脂基托对变异链球菌和白色假丝酵母菌抗菌性的

载银纳米二氧化钛树脂基托对变异链球菌和白色假丝酵母菌抗菌性
的体外研究
目的采用体外法研究载银纳米二氧化钛（Ag-TiO2）树脂基托对口腔常见条件致病菌的单一游离菌体及菌斑生物膜的抗菌性能。

方法将不同质量分数的Ag-TiO2抗菌粉剂添加到树脂基托材料中，制成抗菌树脂基托。

采用薄膜密贴法分别检测该抗菌树脂基托对变异链球菌、白色假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌的抗菌率，并用扫描电镜观察抗菌树脂基托表面变异链球菌、白色假丝酵母菌的生长情况。

结果与未添加抗菌剂相比，抗菌剂质量分数为0.7%时，抗菌树脂基托对金黄色葡萄球菌的抗菌率达93.3%；抗菌剂质量分数为1.5%时，抗菌树脂基托对变异链球菌的抗菌率达90.2%；抗菌剂质量分数为2.5%时，抗菌树脂基托对白色假丝酵母菌的抗菌率也达91.2%。

与未添加抗菌剂相比，抗菌树脂基托表面变异链球菌、白色假丝酵母菌的黏附数量明显减少。

结论Ag-TiO2可以显著提高树脂基托的抗菌性能。

标签：载银纳米二氧化钛树脂基托；抗菌性能；菌斑
Study of antibacterial effect of polymethyl methacrylate resin base containing Ag-TiO2 against Streptococcus mutans and Saccharomyces albicans in vitro Liu Jie1, Ge Yali1, Xu Lianli2. （1. Dept. of Prosthodontics, School of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154002, China; 2. Dept. of Denture Production, School of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154002, China）
[Abstract] Objective To study the antibacterial effect of polymethyl methyacrylate（PMMA）resin base containing
Ag-TiO2 antibacterial agent against common conditioned pathogen and their bacterial plaque in vitro. Methods Diffe-rent qualities of Ag-TiO2 antibacterial agent were added into PMMA resin base in order to prepare antibacterial PMMA resin base. Then, in vitro analysis of antibacterial effect of the resin base against Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Saccharomyces albicans were assayed with the pellicle-sticking method. Furthermore, the growth of Streptococ-cus mutans and Saccharomyces albicans bacterial plaque on the antibacterial PMMA resin base were examined by scanning electron microscope. Results The inhibition percent for Staphylococcus aureus was 93.3% by antibacterial PMMA resin base with 0.7% Ag-TiO2; for Streptococcus mutans 90.2% with 1.5% Ag-TiO2; for Saccharomyces albi-cans 91.2% with 2.5% Ag-TiO2. Bacterial plaque of Streptococcus mutans and Saccharomyces albicans on antibacterial resin base were inhibited effectively. Conclusion The antibacterial property of the PMMA resin base is effectively enhanced with Ag-TiO2 antibacterial agent.
[Key words] polymethyl methacrylate resin base containing Ag-TiO2；antibacterial effect；bacterial plaque
随着全球逐渐步入老龄化社会，佩戴活动义齿或全口义齿的患者越来越多。

义齿的戴入常造成口腔原有微生态环境改变，导致口腔条件致病菌增多；聚甲基丙烯酸甲酯制成的人工牙及树脂基托由于其独特的理化性能，易黏附细菌、真菌且难以彻底清除，从而继发一系列口腔疾病[1]。

因此，如何提高义齿的抗菌性
能是目前国内外关注的热点之一。

近年来，无机抗菌剂凭借其抗菌谱广、抗菌时效长、耐高温、生物安全性好等特性得到国内外学者一致认可。

无机抗菌剂中，一类是通过物理吸附、离子交换等方法，将银、铜、锌等抗菌金属离子负载在沸石、硅胶等多孔材料表面制成的抗菌剂；另一类是利用材料自身光催化作用产生大量含氧自由基（reactive oxygen species，ROS）发挥杀菌作用的钛类（TiO2）抗菌剂[2]。

本研究将载银纳米二氧化钛（Ag-TiO2）抗菌剂添加到树脂基托中，采用体外实验，探讨抗菌树脂基托对变异链球菌、金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母菌单一游离的细菌、真菌的抗菌作用，并用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察抗菌树脂基托表面菌斑生物膜的生长情况。

1 材料和方法
1.1 实验菌株
变异链球菌（Streptococcus mutans，ATCC257-
15）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATC-C29213）、白色假丝酵母菌（Saccharomyces albicans，ATCC90028）购自广东微生物保藏中心。

1.2 主要材料和仪器
载银纳米二氧化钛抗菌粉剂（中南大学冶金研究所提供，平均晶粒粒径10～30 nm），贺利氏热凝牙托粉与热凝单体（日进齿科材料昆山有限公司），BHI培养液/培养基、沙堡培养液/培养基（无锡市赛维商贸有限公司），PE膜（天津市润生塑胶制品有限公司），超净工作台（上海净化设备厂），恒温培养箱（天津市实验仪器厂），血球计数板（盐城市恒泰玻璃仪器厂），微量加样器[研域（上海）化学试剂有限公司]，S-450型扫描电镜（日立公司，日本）。

1.3 实验方法
1.3.1 菌液配置用BHI培养液分别复苏变异链球菌、金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母菌冻干菌株。

采用连续转接2次之后的新鲜菌液培养物，挑取变异链球菌和金黄色葡萄球菌单菌落混悬于BHI培养液中，37 ℃下分别厌氧和需氧培养24 h；挑取白色假丝酵母菌单菌落混悬于沙堡培养液中，37 ℃下需氧培养24 h。

血球计数板分别配置密度为1×105 CFU·mL-1的3种菌液，备用。

1.3.2 实验样品制备根据《中华人民共和国轻工行业标准——抗菌塑料抗菌性能试验方法和抗菌效果》
（QB/T 2591—2003）[3]中试件制备方法制备实验样品。

按照质量比，在100 g牙托粉中分别加入0.3、0.5、0.7、1.5、2.0、2.5 g的Ag-TiO2抗菌剂，球磨法混匀，即含抗菌剂的质量分数分别为0.3%、0.5%、0.7%、1.5%、2.0%、2.5%，按临床常规制作热凝型树脂基托的方法制作规格为（50±2）mm×（50±2）mm×2 mm
的6组不同质量分数的抗菌剂树脂基托，以未添加抗菌剂的树脂基托作为空白对照组，每组6个。

以上所有试件均用1 200目水砂纸打磨、抛光，备用。

实验前用70%乙醇擦拭样品表面，1 min后无菌水冲洗，自然干燥备用。

1.3.3 薄膜密贴法检测抗菌树脂基托抗菌效果参考《中华人民共和国轻工行业标准——抗菌塑料抗菌
性能试验方法和抗菌效果》（QB/T 2591—2003）[3]，采用薄膜密贴法检测抗菌树脂基托抗菌率。

将各组样品置于直径90 mm的培养皿内，分别取0.2 mL 各菌悬液滴加在各样品表面，PE膜覆盖，铺平，使菌液均匀接触样品。

变异链球菌在37 ℃、相对湿度大于90%的情况下厌氧培养24 h；金黄色葡萄球菌和白
色假丝酵母菌在37 ℃、相对湿度大于90%的情况下需氧培养24 h。

之后，用20 mL PBS液反复洗脱各样品和PE膜，充分混匀洗脱液，10倍稀释至10-3，取0.1 mL洗脱液分别接种至BHI和沙堡平板培养基上。

变异链球菌在37 ℃下厌氧培养24 h，金黄色葡萄球菌和白色假丝酵母菌在37 ℃下需氧培养24 h后，进行菌落计数。

实验重复3次。

计算抗菌率R，R（%）=（空
白对照样品平均回收菌落数-抗菌样品平均回收菌落数）/空白对照样品平均回收菌落数×100%。

R≥99%为有强抗菌作用，R≥90%为有抗菌作用。

1.3.4 扫描电镜观察抗菌树脂基托表面菌膜生长情况将
2.0 g抗菌剂添加至100 g牙托粉中，常规方法制备直径为10 mm的抗菌树脂基托小圆片，不含抗菌剂的树脂基托为空白对照，每组3个。

取最新配置密度为1×105 CFU·mL-1的变异链球菌、白色假丝酵母菌菌液各1 mL，分别置于2 mL BHI和2 mL沙堡培养基中，取2组树脂基托各3个悬挂于菌液中，37 ℃下分别在厌氧和需氧环境中培养48 h；之后，取出试件，PBS液冲洗3次，戊二醛固定，乙醇梯度脱水，扫描电镜观察变异链球菌、白色假丝酵母菌在抗菌树脂基托表面生长情况，并在2 000倍下随机挑选计算10个视野下的菌落数，具体为：以半径为5 μm的圆作为一个视野，选取每张图片上左上角、右上角、左下角、右下角、正中央5个区域各2个视野的菌落数进行计数。

1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计分析，对菌落数的差异进行单因素方差分析。

2 结果
2.1 不同剂量抗菌剂的树脂基托对口腔常见菌的抗
菌效果
添加Ag-TiO2的树脂基托能有效抑制变异链球菌、金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母菌的生长，菌落形成数与空白对照相比有统计学差异（表1），且随着抗
菌剂质量分数的增加，抗菌率亦随之提高。

与空白对照相比，抗菌剂质量分数为0.7%时，抗菌树脂基托对金黄色葡萄球菌的抗菌率达93.3%；抗菌剂质量分数为1.5%时，抗菌树脂基托对变异链球菌的抗菌率达90.2%；抗菌剂质量分数为2.5%时，抗菌树脂基托对变异链球菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率达99% 以上，对白色假丝酵母菌的抗菌率也达91.2%。

2.2 变异链球菌、白色假丝酵母菌在树脂基托表面
生长情况
变异链球菌、白色假丝酵母菌在树脂基托表面的生长情况见图1。

由图1可见，与未添加抗菌剂的空白对照组相比，添加抗菌剂的树脂基托表面黏附生长的变异链球菌和白色假丝酵母菌的数量明显减少；未添加抗菌剂的树脂基托表面这2种菌的菌体多黏附、聚集在一起，而添加抗菌剂的树脂基托表面黏附的菌体大多相对独立、分散。

变异链球菌在未添加和添加抗菌剂的树脂基托表面黏附的菌数分别为52.5±4.6、8.3±3.8，白色假丝酵母菌在未添加和添加抗菌剂的树脂基托表面黏附的菌数分别为69.1±3.2、24.7±5.1，统计分析表明，2种细菌在未添加抗菌剂与添加抗菌剂时黏附的菌数间有统计学差异（P＜0.05），与空白对照相比，抗菌
树脂基托表面变异链球菌、白色假丝酵母菌的黏附数量明显减少。

3 讨论
各国学者很早便采用多种途径来改善义齿树脂基托的抗菌性能。

Srinivasan
等[4]对24例戴用全口义
齿的患者口腔进行了21 d观察，发现使用义齿清洁剂的患者其口腔卫生明显优于仅仅采用机械法清洁义齿的患者的口腔卫生。

然而，清洁剂中有些成分会破坏树脂基托材料，且有效药物浓度持续时间短，限制了其应用。

通过树脂基托表面改性的方法（如上
釉、涂层、镀膜等）也可改变树脂基托表面理化特
性，减少菌斑黏附。

李斌等[5]将纳米非晶金刚石膜涂
覆于热凝树脂基托表面，发现二者结合牢固，生物相容性良好，薄膜高度透明、硬度高、耐腐蚀磨损，可以显著降低白色假丝酵母菌黏附。

Murata等[6]报道四季铵通过离子作用、疏水作用与细菌细胞膜作用可发挥杀菌效果，含四季铵的热凝树脂基托能有效地抑制其表面微生物，但抗菌剂呈暴发性释放，有效浓度持续时间短，不耐高温。

很早之前人们就认识到银具有高效杀菌作用。

有关银对微生物的灭活机制主要有2种观点：一种是接触反应机制，带正电的银离子与带负电的致病菌细胞膜接触后，发生牢固的库伦吸引，银离子与细胞内部氧化代谢酶的巯基（-SH）发生反应，破坏微生物蛋白结构，微生物窒息死亡[7-8]；另一种是与光催化类（TiO2）抗菌剂相同抗菌机制的活性氧机制[9]。

无机抗菌剂中TiO2光催化类抗菌剂在接受长波
紫外线照射后，能在TiO2粒子表面产生大量ROS，如HO-、O2-、H2O2等，特别是强氧化性的HO-容易与致病菌细胞膜的脂质、细胞内的酶、核酸等生物大分子发生链式反应，灭活致病菌，并且还能将杀菌后有毒物质进一步代谢分解[10]。

当Ag+嵌入到TiO2晶
体时，降低了TiO2光生电子的跃迁禁带宽度，使TiO2抗菌剂不必依赖长波紫外线，在自然光条件下，即可发挥抗菌作用，实现二者协同抗菌[11]。

当然，任
何抗菌剂在杀灭微生物同时对人体细胞也会产生一定毒副作用，关于Ag+的体内蓄积、对机体的毒性作用等也是学者们一直关注的。

张富强等[12]通过体外细胞毒性试验，比较6种纳米载银无机抗菌剂的生物安全性，指出抗菌剂质量分数小于等于25 g·L-1时，对人体安全无毒。

陈良建等[13]研究也证实添加有2% Ag-TiO2的硅橡胶不仅对细胞无毒，而且有利于细胞黏附。

本实验选用结合纳米材料特性、银系、二氧化钛系抗菌剂特性的Ag-TiO2作为抗菌剂添加到树脂基托材料中。

检测不同性质抗菌材料的抗菌性能，需要采用不同的检测方法和评价手段，如抑菌环法、振荡法、浸渍法、薄膜密贴法等[14]。

根据《中华人民共和国轻工行业标准——抗菌塑料抗菌性能试验方法和抗菌效果》（QB/T 2591—2003），对于抗菌型硬质表面的塑
料应采用薄膜密贴法检测含有不同浓度抗菌剂的树脂基托抗菌性能。

本研究发现：与空白对照组相比，Ag-TiO2抗菌树脂基托对其表面变异链球菌、白色假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用，且随着抗菌剂添加剂量的增加，抗菌效果增强。

这与其他学者的研究相符。

Kuroki等[15]研究指出在自凝树脂中加入1%纳米含银抗菌剂后，能明显抑制变异链球菌的残存量和在树脂表面的黏附量。

李罡等[16]将
1.25%和
2.5%纳米载银抗菌剂加入树脂基托，有效地抑制了牙龈卟啉单胞菌和白色假丝酵母菌的生长，8%的抗菌剂可完全抑制口腔常见细菌生长。

导致口腔疾病发生的重要始动因子是牙菌斑，其致病性是游离单一致病菌的50～5 000倍。

抗菌性能良好的树脂基托不仅要能灭活单一致病菌，还要能防止菌斑生物膜的形成。

本实验用SEM观察培养48 h后抗菌树脂基托表面菌膜形成情况，发现与对照组相比，抗菌树脂基托表面黏附生长的变异链球菌、白色假丝酵母菌明显减少。

牙菌斑生物膜的形成历经黏附、共聚、菌斑成熟3个阶段，菌膜的形成需要大量单个游离微生物不断堆积，数量和密度达到一定阈值后才产生群体致病效应。

抗菌树脂基托在菌膜形成前就可以显著抑制致病菌生长，减少其数量，从而对菌膜的形成有
抑制作用。

Ebi等[17]将添加有抗菌黏结单体甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶的复合树脂置于1×106 CFU·mL-1变异链球菌菌悬液中，培养24 h后，与对照组相比，抗菌复合树脂能有效地抑制其表面变异链球菌菌膜的形成。

本研究结果与之相符。

菌斑生物膜的形成是有多种因素参与的复杂过程。

例如，致病菌细胞表面蛋白特异性、致病菌存在的时间、菌液浓度、流体动力因素、表面材料的理化性质、细菌表面鞭毛、菌毛等。

李罡等[16]研究报道：在16 d时间里，含银抗菌剂的树脂基托未能抑制细菌在其表面黏附。

与之相比，本实验观察菌膜时间短，添加的抗菌剂种类不同，抗菌剂颗粒粒径也不同，从而导致实验结果存在差异。

本实验表明：在树脂基托材料中添加Ag-TiO2抗菌剂能有效提高树脂基托抗菌作用，且添加剂质量分数为 2.5%时对变异链球菌、白色假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌的抗菌效果均较好；与对照组相比，Ag-TiO2树脂基托对其表面菌膜形成有抑制作用。

但是，由于体外实验环境与口内复杂的微环境相距较大，例如，薄膜密贴法会影响白色假丝酵母菌需氧生长的条件，在口内这种光照不充足条件下Ag+和TiO2又是如何发挥协同抗菌效应，抗菌树脂基托的机械性能和颜色如何等等，仍需要进一步地深入研究。

[参考文献]
[1] Busscher HJ, Rinastiti M, Siswomihardjo W, et al. Biofilm for-mation on dental restorative and implant materials[J]. J Dent Res,
2010, 89（7）：657-665.
[2] 于延芬, 郑粟, 柴立元, 等. 二氧化钛载银抗菌剂的研究进展[J].
环境污染治理技术与设备, 2004, 5（12）：16-20.
Yu Yanfen, Zheng Su, Chai Liyuan, et al. Progress of study on
the anti-bacterial materials of Ag-embedding titanium oxide[J].
Techniques Equipment Environmental Pollution Control, 2004, 5
（12）：16-20.
[3] 全国塑料制品标准化技术委员会. QB/T 2591—2003 抗菌塑料抗
菌测试[S]. 北京：中国轻工业出版社, 2003.
National Plastic Products Standardization Technical Committee . QB/
T 2591—2003. Antisepsis test of antisepticise plastics[S]. Beijing：
China Light Industry Press, 2003.
[4] Srinivasan M, Gulabani M. A microbiological evaluation of the use
of denture cleansers in combination with an oral rinse in complete
denture patients[J]. Indian J Dent Res, 2010, 21（3）：353-356.
[5] 李斌, 姚月玲, 安银东, 等. 纳米非晶金刚石膜抗口腔白色念珠
菌黏附作用的研究[J]. 中国美容医学, 2005, 14（2）：203-204.
Li Bin, Yao Yueling, An Yindong, et al. Study on the adhering
of Candida albicans on the surface of acrylic denture resin sub-
strates with nanometer amorphous diamond film[J]. Chin J Aesthe-
tic Medicine, 2005, 14（2）：203-204.
[6] Murata H, Koepsel RR, Matyjaszewski K, et al. Permanent, non-
leaching antibacterial surface—2：How high density cationic sur-
faces kill bacterial cells[J]. Biomaterials, 2007, 28（32）：4870-4879.
[7] 王洪水. 纳米银及纳米载银抗菌材料的研究[D]. 武汉：华中科
技大学, 2006：3-6, 10.
Wang Hongshui. Study on nano-silver and silver loaded nano-
antimicrobial[D]. Wuhan：Huazhong University of Science and Te-
chnology, 2006：3-6, 10.
[8] Slawson RM, Lee H, Trevors JT. Bacterial interactions with silver
[J]. Biol Met, 1990, 3（3/4）：151-154.
[9] 何金山, 守屋好文, 桶田岳见, 等. 银与光所产生的协同效应的
微生物灭活机理及其家电产品中的应用[J]. 生物工程学报, 2008,
24（6）：1091-1097.
He Jinshan, Yoshifumi Moriya, Takemi Oketa, et al. Inactivation
mechanism of microorganisms by the synergy of silver and light
irradiation, and the application in household electrical appliances
[J]. Chin J Biotechnology, 2008, 24（6）：1091-1097.
[10] Sawada T, Yoshino F, Kimoto K, et al. ESR detection of ROS ge-
nerated by TiO2 coated with fluoridated apatite[J]. J Dent Res,
2010, 89（8）：848-853.
[11] 苑春, 彭兵, 柴立元, 等. 载银二氧化钛光催化杀菌性能的研究
[J]. 应用化工，2005, 34（1）：40-42, 60.
Yuan Chun, Peng Bing, Chai Liyuan, et al. Study on photocata-
lytic sterilization performance of titanium dioxide load silver[J]. Ap-plied Chemical Industry, 2005, 34（1）：40-42, 60.
[12] 张富强, 佘文珺, 傅远飞. 六种纳米载银无机抗菌剂的体外细
胞毒性比较[J]. 中华口腔医学杂志, 2005, 40（6）：504-507.
Zhang Fuqiang, She Wenjun, Fu Yuanfei. Comparison of the cy-
totoxicity in vitro among six types of nano-silver base inorganic
antibacterial agents[J]. Chin J Stomatol, 2005, 40（6）：504-507.
[13] 陈良建, 黄冬梅, 张思慧, 等. 添加载银纳米TiO2对硅橡胶抗菌
性能及生物相容性的影响[J]. 中南大学学报：自然科学版, 2010,
41（2）：526-531.
Chen Liangjian, Huang Dongmei, Zhang Sihui, et al. Effect of ad-
dition of Ag-embedded nano-TiO2 on antibacterial activity and
biocompatibility of silicone rubber[J]. J Central South University：
Science Technology, 2010, 41（2）：526-531.
[14] 葛伟青, 苑少强, 郝斌. 无机抗菌材料的应用及其抗菌性能测
试和评价[J]. 陶瓷, 2007（7）：53-55.
Ge Weiqing, Yuan Shaoqiang, Hao Bin. The application of inor-
ganic antibacterial material and its test and evaluation of antibac-
terial properties[J]. Ceramics, 2007（7）：53-55.
[15] Kuroki K, Hayashi T, Sato K, et al. Effect of self-cured acrylic resin added with an inorganic antibacterial agent on Streptococcus mutans[J]. Dent Mater J, 2010, 29（3）：277-285.
[16] 李罡, 陈治清, 吴兴惠, 等. 含银无机抗菌剂加入树脂中对口腔常见细菌黏附影响的研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2007, 25（3）：280-284.
Li Gang, Chen Zhiqing, Wu Xinghui, et al. Study of adherence of normal oral bacteria on polymethyl methyacrylate containing sil-
ver supported silicate inorganic antibacterial[J]. West China J Sto- matol, 2007, 25（3）：280-284.
[17] Ebi N, Imazato S, Noiri Y, et al. Inhibitory effects of resin com- posite containing bactericide-immobilized filler on plaque accu- mulation[J]. Dent Mater, 2001, 17（6）：485-491.
（本文编辑李彩）。