GC-MS

GC-MS/MS法测定发酵食品中氨基甲酸乙酯的
含量
陈大鹏
（黑龙江农业职业技术学院，黑龙江佳木斯 154000）
摘　要：本文建立了气相色谱-一三重四极杆串联质谱法测定发酵食品中氨基甲酸乙酯的方法。

该测定方法同时考虑到液体基质与固体基质，样品中加入D5-氨基甲酸乙酯作为内标，采用多反应监测方式进行结果监测，并通过该方法对市售的8种发酵食品进行测定。

结果表明，氨基甲酸乙酯线性关系良好，相关系数为0.999 9，峰面积的相对标准偏差为1.57%，选取的典型液体基质与固体基质的平均回收率均超过了100%。

该方法可以准确测定市售发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量，整体准确性较高。

关键词：发酵食品；气相色谱 - 三重四极杆串联质谱法；氨基甲酸乙酯Determination of Ethyl Carbamate Content in Fermented
Foods by GC-MS/MS
CHEN Dapeng
(Heilongjiang Agricultural V ocational and Technical College, Jiamusi 154000, China) Abstract: This article establishes a method for the determination of ethyl carbamate in fermented food using gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry. This measurement method takes into account both liquid and solid matrices, and adds D5 aminoethyl formate as an internal standard to the sample. The results are monitored using a multi reaction monitoring method, and eight commercially available fermented foods are measured using this method. The results showed that the linear relationship of ethyl carbamate was good, with a correlation coefficient of 0.999 9. The relative standard deviation of peak area was 1.57%, and the average recovery rates of the selected typical liquid and solid matrices exceeded 100%. This method can accurately determine the content of ethyl carbamate in commercially available fermented foods, with overall high accuracy.
Keywords: fermented foods; gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry; ethyl carbamate
氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）是发酵食品在发酵与储存过程中形成的污染物，属于2A类致癌物，广泛存在于黄酒、酱油等食品中[1]。

《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》（GB 5009 223—2014）针对食品中EC的测定制定了详细的标准，表明了国家对其测定工作的重视程度[2]。

目前，EC测定方法主要有气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）、分子印迹法和免疫分析法等，而上述方法存在定量不准确等问题[3]。

考虑到EC广泛存在于各类发酵食品中，本文提出采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法进行发酵食品中EC的测定，了解发酵食品中EC 的污染情况，从而识别其食品安全风险，指导消费者合理饮食[4]。

1　材料与方法
1.1　材料、试剂与仪器
白酒、料酒、酱油、醋、腐乳、发酵乳、豆豉以及面包，市售。

Agilent 7890A/7000bGC-MS/MS三重四极杆气相色谱串联质谱仪，美国安捷伦科技有限公司；Sartorms CPA225D电子天平，德国赛多利斯公司；TDZ5-WS台式低速自动平衡离心机，长沙湘智离
作者简介：陈大鹏（1979—），男，黑龙江安达人，本科，副教授。

研究方向：食品科学。

心机仪器有限公司；HP-5016SY氮吹仪，上海济成分析仪器有限公司；默克Milli-Q超纯水机，美国Millipore公司；MS3基本型涡旋混合器，德国IKA 公司；ST-700A搅碎机，常州国华电器有限公司。

EC标准品（纯度＞99%），德国Dr．Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯，美国TEDIA公司；氯化钠、无水硫酸钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；色谱级甲醇、乙腈，美国Burdick-Jackson 公司；硅藻土萃取柱，天津博纳艾杰尔科技有限公司；D5-氨基甲酸乙酯，CDNISOTOPES。

1.2　标准溶液配制
称取10 mg EC标准品于10.0 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1 mg·mL-1的标准储备液，采用同样的方式制备质量浓度为1 000 μg·L-1的D5-氨基甲酸乙酯内标使用液。

将不含有EC成分的同基质物质作为空白样品，适量吸取质量浓度为1 000 μg·L-1的混合对照品中间液，采用氮吹仪吹至近干，制备成1 mg·mL-1基质标准使用液。

分别吸取0.01 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL和3.20 mL中间液，采用乙酸乙酯定容，制备成质量浓度为1 μg·L-1、l0 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、160 μg·L-1和320 μg·L-1的EC标准系列溶液。

1.3　样品前处理
液体基质：样品摇匀后称取1 g放入10 mL试管中，加入25 μL 10 μg·mL-1内标中间液，除了酱油以外，其他样品均加入0.3 g氯化钠，涡旋振荡5 s，溶解混匀后放入SPE小柱，静置10 min后，采用正己烷进行淋洗，之后采用乙醚-乙酸乙酯进行洗脱处理，收集到的洗脱液于40 ℃以下采用氮吹仪吹至近干，并用甲醇定容，制备成供试液。

固体及半固体基质：样品绞碎后称取1 g放入10 mL试管中，加入25 μL 10 μg·mL-1内标中间液，涡旋振荡5 s后，加入0.5 g氯化钠、1.5 mL乙腈和0.5 mL超纯水，涡旋振荡120 s后，3 000 r·min-1离心15 min，取1 mL上清液过0.22 μm滤膜，待分析。

1.4　仪器条件
（1）色谱条件。

毛细管色谱柱，DB-INNOWAX （30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进出口温度：190 ℃；载气：高纯氮气；进样方式：脉冲不分流，0.9 mL·min-1的恒流模式；进样量：1 μL；柱温：50 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1升温至150 ℃保持2 min，再以30 ℃·min-1升温至250 ℃保持5 min。

（2）质谱条件。

电离方式：电子轰击电离；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：250 ℃；监测方式：多反应监测方式；溶液延迟：5 min。

2　结果与分析
2.1　碰撞能优化
采用单四极杆质谱获取到EC的特征粒子包括m/z 44、m/z 62、m/z 74、m/z 89，实际样品处理后进样，最终选取丰度大且干扰小的m/z 62作为母离子，开展碰撞能优化实验。

取一定量的标准溶液，分别在10～40 eV（每10 eV设定一个等级）的不同碰撞能下进样，结果如表1所示。

在20 eV碰撞能下可以获取最大丰度，子离子分别为m/z 44、m/z 44.9，丰度比为100∶33.5。

表1　碰撞能实验
碰撞能/eV子离子（m/z）丰度值
10
43.9 3 457.94
44.9567.56
45.3322.42
20
44 5 453.26
44.9 1 828.57
30
44.1 4 400.21
45 1 289.20
40
44.1 2 910.31
45.1936.29
2.2　方法学评价
2.2.1　线性关系、检出限与定量限
分别以对照品浓度与对应峰面积为横纵坐标，进行线性回归，获得的标曲回归方程为y=0.007 8x-0.023 9，相关系数R2=0.999 9，接近于1，线性关系良好。

分别以3倍信噪比和10信噪比为基准，进行化合物检出限与定量限测定，得到EC检出限为3 ng·mL-1，定量限为10 ng·mL-1。

2.2.2　稳定性
将制备好的供试品溶液在室温内进行首次测定，之后分别在2 h、4 h、12 h、24 h、48 h进样测定，并记录相应的EC峰面积，通过EC峰面积的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）大小反映测定结果的准确性。

测定结果显示，不同时间段下EC 峰面积的相对标准偏差为1.57%，小于国际联合委员会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）提出的峰面积相对标准偏差应＜2.0%的要求，说明供试品在48 h内始终保持稳定状态。

2.2.3　加标回收试验结果
精密称取已测定含量的样品，加入内标中间液
（液体基质100 μL，固体基质500 μL），制备加标回收率测定样品溶液，针对液体基质（料酒）和固体基质（面包）进行加标回收实验，结果见表2。

可以看出，液体基质与固体基质的平均回收率分别为100.17%、100.23%，相对标准偏差均小于5%，说明方法准确可靠。

2.3　实际样品的测定
采用本文建立的方法对市售白酒、料酒、酱油、醋、腐乳、发酵乳、豆豉和面包8种发酵食品中的EC含量进行测定，每种发酵食品各10份，测定结果取平均值。

如表3所示，市售发酵食品中EC的平均含量为3.44～84.63 ng·g-1。

在各类市售发酵食品中，腐乳中的EC平均含量最高，为84.63 ng·g-1，且检测出的最高EC含量达到了246.82 ng·g-1，检出率达到了100.00%。

在日常饮食中，可将腐乳作为风味调味品使用，但不宜过多食用，以避免其对人体造成伤害。

酒类发酵食品中EC平均含量也较高，白酒与料酒中的EC平均含量分别为48.24 ng·g-1与20.87 ng·g-1，检出率均达到了100.00%。

且白酒中的EC含量相对更高，考虑到白酒的度数较高，日常饮食中一般不会出现过度饮用的现象，且EC处于酒类国际安全限量标准以内，对人体几乎不会造成伤害[5]。

而料酒的主要功能是调味，其含量与酱油、醋等日常家用调味品相近，过多食用的概率较小，整体较为安全。

豆豉、发酵乳、面包等发酵食品中的EC平均含量均处于较低水平，检出率相对较低。

综上，本文选取的市售发酵食品中的EC含量整体处于合理范围，食用量大的发酵食品EC含量较低，而EC含量较高的发酵食品多为调味品或食用量较小的白酒饮品，整体安全性可以得到保障。

表2　EC在液体基质和固体基质中的加标回收率
基质内标EC含量/μg添加对照品量/ng测得量/ng回收率/%平均回收率/%RSD/%
液体基质D5-氨基
甲酸乙酯
25.0421035.00299.89
100.17
2.17
25.058100125.324100.05 3.02
25.012200226.312100.58 2.98
固体基质D5-氨基
甲酸乙酯
110.45050155.42096.87
100.23
2.32
110.762500625.362102.39 1.14
110.510 1 000 1 126.284101.42 1.62
表3　市售发酵食品中EC含量的测定结果
样品平均值/（ng·g-1）含量范围/（ng·g-1）检出率/%
白酒48.247.46～132.21100.00
料酒20.870～68.4100.00
酱油16.820～36.8492.64醋14.860～48.6396.22
腐乳84.630～246.82100.00
发酵乳 3.680～10.6460.00
豆豉7.820～58.7660.00
面包 3.440～10.4140.00
3　结论
EC污染是近些年食品领域面临的主要安全问题。

本研究提出了将GC-MS/MS法应用到发酵食品中EC含量的测定工作中，通过方法学评价验证了该方法在测定发酵食品中EC含量的有效性。

同时，采用GC-MS/MS法对8类市售发酵食品中的EC含量进行测定，测定结果显示，各类发酵食品均有一定量的EC，以腐乳EC含量最高，豆豉、发酵乳、面包的EC含量低，整体表现出食用量与EC含量呈现反比的关系，即食用量大的豆豉、发酵乳、面包EC 含量相对较低，而食用量较小，往往作为调味品的腐乳、白酒与日用调味品的EC含量相对较高，说明国内市售发酵食品的EC含量处于合理范围，整体安全性较高。

参考文献
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[3]马晓驰,金诺,刘佳萌,等.发酵食品中氨基甲酸乙
（下转第91页）
不同体积油标稀释液Ⅰ进行加标回收试验；同时采用标准《食品安全国家标准食品中多元素的测定》（GB 5009.268—2016）推荐的方法进行方法对照试验，结果见表3。

由表3可以看出，镉、铅元素测定结果的RSD（n=6）分别为3.1%和2.3%，加标回收率分别为94%和105%。

运用t检验分析实验方法结果与标准方法结果，结果表明两种方法之间无统计学差异（P＞0.05）[11]，这说明所建立的破乳诱导萃取-动能歧视-电感耦合等离子体质谱法准确、可靠。

2.6　实际样品分析
采用本实验优化后的方法对市售的3种常见食用植物油（菜籽油、葵花子油、花生油）进行成分分析，所有样品平行测定6次，结果见表4。

3种食用植物油中铅、镉元素含量均在GB 2762—2022标准要求
表3　样品中Cd、Pb元素的测定结果和加标回收率
元素
实验方法标准方法
测定值/（ng·g-1）
P值测定值/（ng·g-1）RSD（n=6）/%加标量/（ng·g-1）测定总量/（ng·g-1）回收率/%
Cd0.46 3.1 1.0 1.40940.490.16 Pb 2.44 2.3 2.0 4.54105 2.360.65
表4　不同食用植物油中镉和铅的分析结果
元素菜籽油/（ng·g-1）葵花子油/（ng·g-1）花生油/（ng·g-1）
Cd0.820.46 1.69
Pb9.62 2.44 4.83
范围内，符合食品安全要求。

3　结论
本研究采用破乳诱导萃取-动能歧视-电感耦合等离子体质谱法测定食用植物油中的重金属镉和铅。

方法准确度和灵敏度高、检出限低，与标准方法相比，油性样品前处理简便快速，测试结果一致性高。

参考文献
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