不同年份茶藨子叶状层菌多糖含量及抗氧化性比较研究

不同年份茶藨子叶状层菌多糖含量及抗氧化性比较研究
刘志庆;郭绍芬;孙清新;冯尚彩;林祥杰
【摘要】The optimum polysaccharide extraction method of Phylloporia ribis (Schumach.:Fr.) Ryvarden (PrR) was chose in this study,and the polysaccharide content and its antioxidant activity of PrR of different years were compared.The results showed that the optimal aqueous extraction method of PrR polysaccharide was as follows:solid-liquid ratio (g/mL) as 1∶ 30,extraction time as 2 hours and extracting for 3 times.The polysaccharide content of annual and biennial PrR was 4.48％ and 4.01％,respectively.The IC50 value of DPPH radical scavenging rate of annual and biennial PrR polysaccharide were 0.190 mg/mL and 0.239 mg/mL respectively.In conclusion,the content of PrR polysaccharide and its antioxidant activity both decreased with the increase of year.%筛选茶藨子叶状层菌多糖的最佳提
取工艺条件,并对不同年份的茶藨子叶状层菌多糖的含量、抗氧化活性进行比较.结
果表明:水提法提取茶藨子叶状层菌多糖的最佳提取工艺为料液比(g/mL)1∶30、
提取时间2h、提取次数3次;一、两年生茶藨子叶状层菌多糖的含量分别为
4.48％、4.01％,多糖对DPPH·清除率的IC50分别为0.190、0.239 mg/mL.可见,茶藨子叶状层菌多糖的含量、抗氧化活性随着年份的增加而减少.
【期刊名称】《山东农业科学》
【年(卷),期】2017(049)001
【总页数】4页(P73-76)
【关键词】茶藨子叶状层菌;多糖;提取工艺;含量;抗氧化
【作者】刘志庆;郭绍芬;孙清新;冯尚彩;林祥杰
【作者单位】临沂大学药学院,山东临沂276005;临沂大学药学院,山东临沂276005;临沂大学药学院,山东临沂276005;临沂大学药学院,山东临沂276005;临沂大学药学院,山东临沂276005
【正文语种】中文
【中图分类】S567.3
菌藻类多糖、紫芝多糖、人参多糖等多糖药物已经在国内上市。

临床研究表明，多糖具有非常强的抗氧化和抗菌等功效，不仅可使机体免疫力增强，而且对机体的毒性非常小，因而多糖的提取与其药理作用研究已经成为现在研究的热门领域之一[1-5]。

茶藨子叶状层菌为一种大型真菌，来源于忍冬科金银花植株上，主要产于山东平邑[6，7]。

其主要的化学成分为甾醇类、三萜类、苯乙烯基吡喃酮类等。

目前国内外初步药理学研究发现，该菌含有白桦脂酸、Hispidin等生理活性物质，具有较大的研究价值。

本试验通过正交试验探究提取时间、提取次数、提取料液比对茶藨子叶状层菌多糖提取率的影响，并探究不同年份茶藨子叶状层菌多糖的抗氧化活性，为开发利用茶藨子叶状层菌提供参考。

1.1 仪器和试剂
电子分析天平、TU-1810紫外可见分光光度计、DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱、TG16-WS台式高速离心机、WK-800A高速药物粉碎机。

葡聚糖标准品、苯酚、浓硫酸，其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法
1.2.1 茶藨子叶状层菌多糖提取工艺优化采用水提法，以提取两年生茶藨子叶状层菌多糖的料液比、提取次数、提取时间为因素，每个因素设计3个水平(表1)。

采用正交试验设计筛选出最佳提取条件。

1.2.2 茶藨子叶状层菌多糖的提取分别精密称取一年生、两年生茶藨子叶状层菌2 g，加水60 mL，微沸0.5 h，浸泡过夜，按照正交试验确定的最佳提取条件提取
茶藨子叶状层菌多糖，纱布过滤，滤液合并、混匀、称量；取滤液10 mL于离心
管中，5 000 r/min离心10 min，弃去沉淀；取上清液2 mL，加无水乙醇8 mL，混匀、过夜，5 000 r/min离心10 min，收集沉淀[2]；用丙酮、无水乙醇、乙醚洗涤，沉淀干燥，得茶藨子叶状层菌多糖粗品；Sevag法除蛋白[8-10]，烘箱中干燥，得茶藨子叶状层菌多糖。

重复3次。

1.2.3 提取多糖的鉴定取适宜浓度的葡聚糖标准品溶液、所提取的两年生茶藨子叶状层菌多糖及二者的混合溶液，按上述溶液、5%苯酚和浓硫酸体积比为2∶1∶5
的比例充分混合，以蒸馏水、5%苯酚和浓硫酸按体积比为2∶1∶5的比例混合作
为空白对照，在400～550 nm波长进行紫外可见光扫描，将各供试溶液的谱图进行比较，初步鉴定提取物是否为多糖。

1.2.4 茶藨子叶状层菌多糖含量测定用干燥至恒重的葡聚糖标准品(分子量20 000)配制0.10 mg/mL的标准品溶液，分别取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL 置于10 mL离心管，加蒸馏水至1 mL，配成浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL，分别加入5%苯酚0.5 mL、浓硫酸2.5 mL，混匀,放置冷却，490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、葡聚糖含量为横坐标得标准曲线[11-14]。

分别将提取得到的茶藨子叶状层菌多糖，蒸馏水稀释至20 mL，取1 mL置于10 mL离心管中，分别加入5%苯酚0.5 mL、浓硫酸2.5 mL，混合均匀，放置冷却，
用紫外可见分光光度计测定490 nm处溶液的吸光度，计算茶藨子叶状层菌多糖
的提取率。

1.2.5 茶藨子叶状层菌多糖抗氧化性试验用乙醇配制浓度为5×10-5 mol/L 的DPPH·溶液，取此溶液2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加入所提取的茶藨子叶
状层菌多糖溶液各4 mL，无水乙醇定容至10 mL，放置30 min后，用紫外分光光度计在517 nm处测定吸光度[15-20]，按下式计算清除率。

DPPH·清除率(%)=(A2-A1)/A2×100
式中：A2为空白对照的吸光度；A1为加茶藨子叶状层菌多糖的吸光度。

由上述所提取的茶藨子叶状层菌多糖浓度与其清除率做图，计算半数抑制率IC50。

2.1 多糖的提取工艺条件
由表2可知，各因素对茶藨子叶状层菌多糖提取率的影响程度依次为：提取时间>提取次数>料液比，水溶液提取茶藨子叶状层菌多糖的最佳提取工艺为A3B2C3。

2.2 提取多糖的鉴定
由图1可知，标准品溶液、不同配比的标准品与提取多糖的混合物、提取多糖的
紫外-可见图谱曲线基本符合，初步说明所提取的物质为多糖。

2.3 样品中多糖含量
由图2可求得回归方程为y=16.206x-0.0268，R2=0.9951，葡聚糖在0～0.05 mg/mL的浓度范围内线性关系良好。

由测定的多糖溶液吸光度计算得出，一年生茶藨子叶状层菌多糖含量分别为
4.51%、4.47%、4.46%，平均含量为4.48%；两年生茶藨子叶状层菌多糖含量分别为4.02%、3.98%、4.04%，平均含量为4.01%。

2.4 提取多糖的抗氧化性
由图3、图4可见，茶藨子叶状层菌多糖对DPPH·的清除率随着浓度的增加而逐步增加，不同浓度两年生茶藨子叶状层菌多糖溶液对DPPH·清除率的回归方程为y=-872.99x2+498.42x-19.225，R2=0.9999；不同浓度一年生茶藨子叶状层菌多糖溶液对DPPH·清除率的回归方程为y=31.842lnx+102.88,R2=0.9977。

计算可得，不同浓度的一年生和两年生茶藨子叶状层菌多糖溶液对DPPH·清除率的
IC50分别为0.190、0.239 mg/mL。

说明，随着茶藨子年份的增加，其抗氧化性活性降低，一年生茶藨子叶状层菌多糖的抗氧化能力大于两年生茶藨子叶状层菌多糖。

①此提取法对茶藨子叶状层菌多糖具有较好的提取率，其最佳提取工艺条件为料液比(g/mL)1∶30、提取时间2 h、提取3次。

②一年生茶藨子叶状层菌的多糖提取率为4.48%，两年生茶藨子叶状层菌的多糖提取率为4.01%。

③所提取的茶藨子叶状层菌多糖对DPPH·具有良好的清除率，表现出良好的抗氧化活性，一年生、两年生茶藨子叶状层菌多糖对DPPH·清除率的IC50分别为0.190、0.239 mg/mL，说明茶藨子叶状层菌多糖的抗氧化活性随着年份的增加而降低。

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