蛋白质定量新技术新方法-文献调研20080627

对于给定的蛋白组混合物，理论肽段占总肽段的分数近似等于实际 测定的MSMS扫描次数占总扫描次数的分数
Computational prediction of proteotypic peptides for quantitative proteomics Bernhard Kuster & Ruedi Aebersold, et al NATURE BIOTECHNOLOGY， 2007，VOLUME 25 NUMBER 1: 125-131
PNAS 2003;100;6940-6945; originally published online May 27, 2003;
1、合成带有稳定同位素标记的肽段作为内标； 2、合成的肽段可以进行磷酸化、乙基化、乙酰化等修饰； 3、采用SIM技术对有限、重要部分蛋白质进行绝对定量。
Absolute Quantification of Proteins in Solutions and in Polyacrylamide Gels by Mass Spectrometry Jan Havlis and Andrej Shevchenko Anal. Chem. 2004, 76, 3029-3036
蛋白质在每个细胞 中的拷贝数(丰度), 与其spectral counts 的关系
该文初步建立了基于spectral count的蛋白质组定量模型,讨论了该模 型的可行性,并运用于相对简单标准Байду номын сангаас白质样品
Molecular & Cellular Proteomics 4:1265-1272, 2005
蛋白质定量的常用方法
1、基于光吸收或发射性质的光谱定量方法，如紫外及 可见光吸收和荧光定量方法； 2、基于色谱或毛细管电泳与紫外光吸收定量方法； 3、基于同位素稀释的质谱定量方法； 4、基于凝胶电泳和光密度度的定量方法； 5、基于抗体和荧光标记的定量方法； 6、蛋白质相对定量方法。
国内外研究现状
1、将nano-ESI 质谱与18O标记肽内标法结合用于溶液或胶上 酶切蛋白质的绝对定量； 2、实验结果表明溶液酶切绝对定量更为准确，而胶上酶切的 准确度受回收率影响较大，因此肽段的选择更为重要； 3、在优化的实验条件下，胶上酶切法可以给出误差小于50％ 的半定量结果。
Quantitative mouse brain proteomics using culture-derived isotope tags as internal standards Yasushi Ishihama, Toshitaka Sato, Tsuyoshi Tabata, Norimasa Miyamoto, Koji Sagane, Takeshi Nagasu & Yoshiya Oda
1、假设一：混合物中存在的任何一种蛋白质的所有肽段出现 的几率是相同的； 2、假设二：仅有一些蛋白质特有肽段总会被重复鉴定； 3、通过四种蛋白质组学技术平台获得的600000鉴定的肽段， 得到4030种酵母蛋白质的16000种特有肽段； 4、基于这些肽段的特征理化性质，发展了一种计算机工具。 该工具可以预测不同生物中蛋白质的特有肽段。对于不同\ 的技术平台，累计准确度大于85％； 5、特有肽段可以用于蛋白质鉴定结果的验证、蛋白质绝对定 量、基因组编码序列的解释或质谱分析流程中某一因素的 表征（酶解、色谱、离子化和裂解）。
Challenges in deriving high-confidence protein identifications from data gathered by a HUPO plasma proteome collaborative study David J States, David W Speicher & Samir M Hanash, et al Nature Biotechnology 24(3): 333 - 338 (2006)
关键是：没有我们自己创新的技术方法；现有的方法在规模化蛋白质定量 时的动态范围、灵敏度、标记反应的完全程度、样品量和成本方面还无法 完全满足蛋白质科学信息化发展的要求；另外，没有规模化蛋白质绝对定 量方法。
研究目标
一、复杂生物样本中蛋白质或肽绝对定量方法；
二、规模化蛋白质绝对定量方法的建立；
三、多重规模化蛋白质相对定量方法。
Philip L. Ross, et al
Molecular & Cellular Proteomics, 2004, 3(12): 1154-1169
基于iTRAQ基本原理进行蛋白质组绝对定量
Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation (iTRAQ) Reproducibility: Implication of Multiple Injections Poh Kuan Chong, Chee Sian Gan, Trong Khoa Pham, and Phillip C. Wright Journal of Proteome Research 2006, 5, 1232-1240
NATURE BIOTECHNOLOGY， VOLUME 23 NUMBER 5 MAY 2005: 617-621
1、报告了一种基于同位素培养标记（CDIT, culture derived isotope tads）用于组织样本的蛋白质组绝对定量方法； 2、基本思想是首先对neuro 2A 细胞进行同位素介质培养标 记； 3、用合成的肽段作为内标对neuro 2A 细胞中的相关蛋白质进 行绝对定量，然后将该细胞作为内标，对同源率97-98％的 脑组织进行绝对定量，获得了103中蛋白质的绝对定量信 息。
1、基于同位素标记相似物作为内标对具有代表性肽段进 行定量，进而对相应的蛋白质进行定量； 2、设计了一种基因编码不同蛋白质中特定肽段于一种蛋 白质（QCAT protein, concatenated protein）并在 E.coli中进行表达、纯化并用于蛋白质绝对定量的方 法。
Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents
蛋白质定量新技术新方法
军事医学科学院放射与辐射医学研究所
2008年6月27日
蛋白质定量问题：
一、蛋白质的定量包括绝对定量和相对定量。 二、蛋白质定量的研究对象包括： 1、纯化后蛋白质的绝对定量； 2、总蛋白质的绝对定量； 3、复杂生物体系中一种或数种蛋白质的绝对和相对定量； 4、复杂生物体系中大多数及全部蛋白质的绝对和相对定量。
2、相对定量方法
（1）在蛋白质水平上，基于两维分离或与荧光标记结合的比 较方法，如2DE、PF-2D和DIGE； （2）基于质谱技术的不同状态的同一种肽段提取的离子流色 谱图比较的方法（非标记定量）； （3）稳定同位素标记方法，包括化学标记和代谢标记，如18O 水标记、同位素酸酐试剂标记、同位素醛试剂标记、 cICAT、iTRAQ和SILAC等; （4）双功能试剂结合金属标记的方法; (5) 同系物标记-SDS-PAGE或2DE结合质谱的蛋白质相对定量 方法。
Published online 24 December 2006, doi: 10. 1038/nbt1270
1、该文建立了一种蛋白质表达绝对定量的模型(APEX) 2、该模型基于蛋白质被质谱检测的spectral counts和肽段 鉴定概率 3、通过该模型对酵母和大肠杆菌蛋白质组进行定量分析,其 结果与western blotting, 2DE, mRNA 结果一致
本文提出了几个公式,用来对spectral count 进行归一化处理 分子,分母分别表示某个蛋白质在质谱中实 际观测的和理论的肽段数
通过归一化,将蛋白质对应的 spectral counts 转化为质量百 分比或摩尔百分比
该图显示的是不同归一化指标与蛋白质浓度的关系,该图告诉我们 emPAI与蛋白质浓度的线性关系最好(图E,F) 该模型的前提是对肽段的理论个数和理论流出时间进行预测,优势在 于可以对样品中的每个蛋白质进行归一化处理,使不同结果更具有可 比性
Molecular & Cellular Proteomics 4:1487-1502, 2005
该文在Spectral count 模型基础上建立了Rsc的归一化方法,并与基于肽色 谱峰面积的定量方法进行了比较.表明两种方法具有较好的相关性
n1,n2 分别为两组差异样品中某个蛋白质的spectral counts; t1,t2 分别为两组 差异样品中所有蛋白质spectral counts 的总和; f1, f2 分别为校正系数.
Multiplexed absolute quantification in proteomics using artificial QCAT proteins of concatenated signature peptides
Robert J Beynon, Mary K Doherty, Julie M Pratt1 & Simon J Gaskell NATURE METHODS，VOL.2 NO.8 AUGUST 2005: 587-589
1、基于对2DE中的一种蛋白质进行35S放射性同位素标记， 然后进行考马氏亮蓝G 250染色； 2、采用Kepler, Image-QuaNT, Melanie 3.0 等软件对其 他蛋白质点进行比较定量； 3、对大多数糖解蛋白质酶进行了绝对定量。
非标记（label free） 定量模型
Yates 实验室的Liu 等提出， 蛋 白质的量与其被质谱鉴定到的肽 段数正相关，并用实验予以初步 证明。该方法的动态范围达到2个 数量级以上。
复杂生物样本中蛋白质定量 文献调研
基于内标法（同位素稀释法）进行蛋白质质谱绝对定量
Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS Scott A. Gerber, John Rush, Olaf Stemman, Marc W. Kirschner, and Steven P. Gygi
通过多次进样对iTRAQ方法的重现性进行考察，表明该方法 具有较好的重现性， CV （coefficient of variation ) 为 0.09 (scattering from 0.14 to 0.04。因此，多次样 品分析是必要的。
基于凝胶电泳进行蛋白质绝对定量方法
Assessing factors for reliable quantitative proteomics based on twodimensional gel electrophoresis Julie Fié Christine Dillmann, Gilles Lagniel2, Marlè Davanture, vet, ne Luc Negroni, Jean Labarre and Dominique de Vienne Proteomics 2004, 4, 1939–1949
1、绝对定量方法 （1）光谱定量 280 nm 光吸收蛋白质定量法； LOWRY蛋白质定量法或改进 LOWRY蛋白质定量法； BCA蛋白质定量法法； BRADFORD蛋白质定量法； Fluoraldehyde蛋白质定量法； ELISA蛋白质定量法等。
(2）稳定同位素稀释法（内标法）用于质谱法进行蛋白质的 绝对定量； （3）多反应检测蛋白质或肽定量法； （4）规模化蛋白质的半绝对定量方法（基于统计方法）。 采用蛋白鉴定的分值与相应蛋白质的丰度的关系 进行半定量的方法； 蛋白质丰度指数（PAIs，protein abundance indices）与相应蛋白质丰度的关系进行半定量的方法； 指数蛋白质丰度指数（emPAIs，exponentially modified protein abundance indices）与相应蛋白质 丰度的关系进行半定量的方法。