CNV-seq技术检测90例发育迟缓患儿基因组拷贝数变异的遗传学分析

doi:10.3969/j.issn.1000-3606.2021.02.012
基金项目：国家人口与生殖健康科学数据中心工程项目（No.2005DKA 32408）
通信作者：薛慧琴 电子信箱：pyxhq@
CNV-seq 技术检测90例发育迟缓患儿基因组拷贝数变异
的遗传学分析
冯 宇1,2 游石琼2 卢洪涌2 孙夏瑜2 武坚锐2 张玉萍2 王振芳2 薛慧琴21.山西医科大学研究生学院儿科医学系（山西太原 030001）； 2.山西省儿童医院
山西省妇幼保健院
（山西太原 030013）摘要：　目的 探讨发育障碍疾病患儿致病性拷贝数变异（CNV ）的特征。

方法 收集2017至2019年诊断为发育迟缓、并经核型分析患儿的临床资料，采集患儿外周血进行基于高通量测序的低深度全基因组测序（CNV-seq ）。

利用ClinVar 、DECIPHER 、OMIM 、DGV 数据库注释CNV 数据，依据ACMG 评估CNV 致病性，并通过PubMed 数据库检索相关报道文献。

结果 检测90例患儿，CNV 阳性18例，阳性率为20%。

其中ACMG 判定致病性，或有报道的致病性CNV 15例，可能致病CNV 3例；意义未明的CNV 32例。

结论 CNV 是导致儿童发育迟缓的重要病因，>1 Mb 的微缺失/重复具有更高致病性，可将CNV-seq 作为产前诊断的重要手段，以有效防治发育障碍相关疾病。

关键词：　低深度全基因组测序；　发育迟缓；　基因组拷贝数变异
Genetic analysis of copy number variation in 90 children with developmental delay by CNV-seq FENG Yu 1,2, YOU Shiqiong 2, LU Hongyong 2, SUN Xiayu 2, WU Jianrui 2, ZHANG Yuping 2, WANG Zhenfang 2, XUE Huiqin 2 (Department of Pediatrics, Graduate School of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shaanxi, China; Shaanxi Children's Hospital (Shaanxi Maternal and Child Health Hospital), Taiyuan 030013, Shanxi, China)
Abstract: Objective To detect copy number variation sequencing (CNV) in children diagnosed with developmental delay (DD). Methods Clinical data of children diagnosed with DD in Shanxi Provincial Children's Hospital (Shanxi Maternal and Child Health Hospital) from 2017 to 2019 were collected, and all patients had karyotype tested. CNV-seq was used to detect CNVs in these patients. ClinVar, DECIPHER, OMIM, DGV and other databases were used as references for data annotation, and the pathogenicity of CNV is classified according to ACMG guideline. Related articles were retrieved through the PubMed database. Results Ninety patients were tested and the diagnostic rate was 20% (18/90). In which 15 patients were found have pathogenic CNVs,and three patients were found have likely pathogenic CNV . In addition, 32 patients carried copy number variation of unknown significance. Conclusion This study confirmed that CNVs were an important cause of DD, and the CNVs > 1Mb in length are more likely pathogenic. In view of this, we recommend that CNVs testing be the first-line test in children with DD. CNV-Seq is a more efficient CNVs detection method based on high-throughput sequencing.
Key words: CNV-seq; developmental delay; copy number variation
发育迟缓（developmental delay ）被定义为患儿有以下某个或多个领域发育实质性延迟：认知，社交/个人发展，言语/语言，粗略/精细运动或日常生活活动[1]；
也可定义为与同龄人相比，难以达到平均的发育标准。

发育显著延迟则是指性能低于适龄、标准参考试验平均值的两个标准差或以上[2]。

发育迟缓的病因十分复杂，其中遗传性疾病是主要病因，包
括染色体畸变和基因突变，但仍有约50%发育障碍患者病因未知[1]。

除了各种不同类型的发育迟缓，多数患者还伴有先天性畸形、自闭症谱系障碍和/或癫痫等先天性异常，这些往往归因于多种不同的遗传性疾病，并且表明发育障碍疾病具有高度的遗传异质性[3]。

低深度全基因组测序（copy number variation sequencing ，CNV-seq ）技术是基于高通量测序
（high
throughput sequencing，HTS）技术，在全基因组范围内进行低深度（通常为0.6X）拷贝数变异（copy number variation，CNV）检测的方法。

与传统的、基于基因组探针技术的CNV检测技术，例如染色体微阵列分析技术（chromosomal microarray analysis，CMA）相比，CNV-seq的基因组覆盖性更好，且有更好或类似的分辨率和更短的检测周期，并且可以检测相关的基因信息。

因此在HTS已临床普及的今天，CNV-seq已成为临床基因检测推荐的首选检测方法[4]。

本研究利用CNV-seq对发育迟缓患儿进行基因组CNV检测，并结合核型分析和临床表型分析病因，探索不同基因组CNV与患者表型之间的关系，为疾病诊断及再次生育提供遗传学依据。

1 临床资料
收集2017至2019年在山西省儿童医院（山西省妇幼保健院）就诊的发育落后患儿的临床资料。

共90例患儿，年龄0~5岁，男52例、女38例。

纳入患儿至少符合以下1个条件：①存在严重体格发育迟缓，即身材矮小；②运动发育障碍，尤其动作协调性方面；
③智力发育落后，伴适应行为缺陷；④语言发育迟缓，不包括听力障碍及构音障碍引起的类型。

同时排除因产伤、出生后中枢神经系统感染和/或头颅损伤等非遗传因素所致者。

本研究经过医学伦理审核（No.IRB-KYHZ-2019- 006），并获得患儿或监护人的知情同意。

采集患儿外周血2 mL，提取基因组DNA后进行染色体CNV 测序。

CNV-seq实验方案及流程：①从血液中提取DNA，并进行质量控制；②构建DNA文库，准备基因组DNA，然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）；
③测序，采用hiseq2500测序仪；④生物信息学分析，检索DECIPHER、OMIM、ClinVar、DGV等数据库进行CNV片段，包括基因组范围以及缺失或重复的功能和关联表型的注释。

根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南[5]将CNV分为临床致病性、临床可能致病性、临床意义不确定性（variant of uncertain significance，VOUS）、可能良性和良性的CNVs。

90例患儿中，48例合并有其他症状，包括心血管系统7例、特殊面容/结构畸形22例、孤独症谱系障碍4例、其他表型15例，以特殊面容或其他多发畸形较为常见。

意义未明的CNV患儿中，13例合并发育迟缓以外的其他表型：先心病2例（心肌肥厚1例、室间隔缺损1例）、自闭症2例、先天性异常/畸形10例（先天
性失明1例，肌无力2例，肌张力增高1例，足内翻1例，足外翻1例，鞘膜积液1例，右手缺如1例，皮肤色素沉着1例，双手姿势异常1例）、特殊面容2例。

90例患儿经CNV-seq技术检测发现，致病性CNV 检出相对高频的是7、8和22号染色体，检测出致病性或可能致病性CNV 18例（表1），阳性率为20.0%；而用染色体核型分析技术仅检测出7例染色体异常，阳性率为7.8%（表2）。

检测出意义未明的CNV 32例（35.6%），其中男性20例，女性12例。

临床意义未明的基因组CNN共42个，其中微缺失31个、微重复11个，染色体CNN相对高频的是1、3、4号染色体，1 Mb及以下的CNV有33个。

CNV-seq技术检出的致病性CNV中，5例同时存在染色体核型异常（表2）。

其中3例患儿（P9~P11）为染色体数目异常，分别为13、18和21三体综合征，1例(P12)为19.84 Mb大片段缺失，能够解释发育迟缓表型。

1例（P1）核型为47,XY,+mar，mar为额外的染色体片段，但染色体核型无法鉴定与患儿表型相关，而CNV-seq检测明确了mar为15号染色体8.92 Mb的重复片段，该片段重复可引起15q11-q13缺失综合征，与发育迟缓、智力障碍有关。

此外，1例（P19）为罗氏易位携带者，核型为45,XY,rob(13,14)，染色体核型无法解释发育迟缓表型，而用CNV-seq技术检测出该患儿3号染色体上存在0.48 Mb微重复，为临床意义未明的染色体拷贝数变异。

1例（P20）女性患儿存在X与11号染色体平衡易位，但CNV-seq技术未发现染色体拷贝数变异。

2 讨论
儿童各种发育障碍是许多高度遗传异质性疾病的主要表型，从单个基因的点突变，到大的染色体变异均可能导致发育迟缓。

以往利用CMA技术研究发现，约15%~20%的儿童发育迟缓患者归因于CNV[6-9]，这与本研究利用CNV-seq所得到的诊断率一致。

CNV-seq技术基于其高通量测序技术，在实现相同分辨率的基础上，检测的效率更高[10]，这对临床诊断尤其重要。

由于发育迟缓的遗传异质性，在诊断时往往需要多种基因检测方法联合应用，以避免遗漏某种基因变异方式，而相同的高通量测序流程最大程度地保证了各种基因检测方法的高效性，以及得益于流程高度自动化结果的稳定性。

本研究应用CNV-seq技术检测90例发育迟缓患儿的基因组拷贝数变异，致病性CNV检出相对高频的是7、8和22号染色体，且检出的微缺失/重复片段大
表1 18例 CNV-seq 检测结果阳性患儿的临床表型及CNV 结果
编号性别年 龄发育商
/智商体格
临床表型
核型分析
CNV-seq 检测结果
(hg 19)
结果注释或参考案例
相关致病基因
P 1男8月
54
X-2SD 发育迟缓，智力障碍
47,XY, +mar dup(15)(q 11.1q 13.1)
（8.92 Mb ）15q11-q13重复综合征PWACR 、MAGEL 2、
NDN 、UBE 3A P 2男1岁57X-1SD 语言发育迟缓，智力
障碍46,XY dup(22)(q 13.31q 13.33)
（6.10 Mb ）
多篇文献报道相关症状SHANK 3
P 3女2岁
50
X-2SD 智力障碍/运动发育
迟缓；动脉导管未闭，脊柱侧弯46,XX
del(6)(q 27)（6.26 Mb ）
多篇文献报道相关症状DLL 1、THBS 2、PHF 10
P 4男3岁64X-2SD 发育迟缓/智力障碍；手指弯曲，指关节运动差46,XY
dup(4)(p 16.3)(3.62 Mb ）,del(14)(q 32.33)(2.3 Mb)多篇文献报道相关症状F AM 53A 、SLBP 、
TMEM 129、
TACC 3P 5女5岁69X-2SD 精神发育迟缓；特殊
面容，视距较窄46,XX del(5)(q 14.3q 23.1) (26.9 Mb ）家族性腺瘤性息肉病APC P 6男3岁72X-1SD 语言发育迟缓46,XX del(22)(q 11.21)（2.56 Mb ）
DiGeorge 综合征
TBX 1
P 7女1岁57X-2SD 语言发育迟缓46,XX del(7)(q 11.23)（1.70 Mb ）Williams-Beuren 综合征ELN
P 8女10月58X-2SD 发育迟缓，智力障碍；特殊面容，眼距宽
46,XX
del(8)(q 21.11q 21.13) （7.6 Mb ）
8q21.11 Microdeletion 综合征PEX 2，ZFHX 4P 9女9月67X-1SD 发育迟缓；特殊面容，唇腭裂47,XX, +13dup(13)(q 12.11q 34)
13号染色体三体（Patau 综合征）ATP 7B 、FLT 3、SLC 25A 15,等P10男7月34X-2SD 发育迟缓；特殊面容/卵圆孔未闭47,XY, +21
dup(21)(q 11.2q 22.3)
21号染色体三体 （Down 综合征）
PCNT 、CBS 、KCNE 1, 等
P11女7月35X-2SD 发育迟缓；多发畸形47,XX, +18
dup(18)(p 11.32q 23)18号染色体三体 （Edwards 综合征）TCF 4、ATP 8B 1、NPC 1, 等P12女1岁
49
X-2SD 发育迟缓；特殊面容
46,XX,del （11) (q 13.5q 21）del(11)(q 13.5q 21) (19.84 Mb)多篇文献报道相关症状
TYR P13女2岁45
X-2SD 发育迟缓；特殊面容；
马蹄足46,XX
dup(8)(q24.22q24.3)(10.64 Mb), del(18)(q 22.3q 23)(7.72 Mb)多篇文献报道相关症状Dup ：GRINA
del ：GALR 1、MBP P14女2月67X-1SD 发育迟缓，姿势异常
46,XX
dup(2)(p25.3p22.3)(35.22 Mb), del(3)(p26.3p26.2)(3.3 Mb ）多篇文献报道相关症状dup ：ACP 1del ：CHL 1、CNTN 4、CRBN P15女2岁55
X-2SD 发育迟缓；特殊面容；
足垫脚走路，左侧上肢肌无力；姿势异常46,XX
del(7)(q 11.23)（1.40 Mb ）Williams-Beuren 综合征
ELN
P16男5岁70X-1SD 语言发育迟缓；特殊
面容46,XY
del(6)(p 23p 22.3)（1.48 Mb ）可能致病（ACMG ）
ATXN 1、JARID 2、
DTNBP 1、MYLIP P17女3岁71X-1SD 发育迟缓；心脏杂音；
房间隔缺损/肺动脉高压46,XX
dup(15)(q 15.1q 22.31)(22.54 Mb)
可能致病（ACMG ）
FBN 1、SEMA 6D 、EID 1P18男7月69X-1SD 发育迟缓
46,XY
dup(15)(q 13.3)(1.04 Mb), dup(22)(q 11.23q 12.1)(0.24 Mb)
可能致病（ACMG ）CHRNA 7
注：del. 染色体微缺失，dup.染色体微重复；X-1SD. 小于1个标准差，X-2SD. 小于2个标准差
多已知与发育迟缓疾病密切相关，表明这些高频致病性CNV具有全球性的流行病学特征，包括了Williams 综合征、8q21.11微缺失综合征和22q11缺失综合征等。

在15例检出临床致病性CNV的患儿中，诊断为Williams-Beuren综合征（WBS）就有2例（P7和P15）。

对比2例WBS患儿，P15缺失序列长度为1.40 Mb，小于P7的1.70 Mb缺失，但2例患儿的CNV均包含有WBS关键基因ELN（OMIM：*130160）的缺失。

尽管目前定义WBS是由7q11.23的1.5~1.78 Mb的微缺失引起[11]，而P15虽然缺失长度为1.40 M，小于WBS 常见的CNV，但2例患儿都有相同的语言发育迟缓，表明导致WBS的主要表型可定位到更小的基因组区域，例如可能是核心基因ELN上，这为WBS基因型-表型研究提供了的案例材料。

P8为8 q21.11-q21.13缺失，长度为7.6 Mb，包含已知的8q21.11微缺失综合征（OMIM：#614230）CNV全长，并且精神发育迟缓（智力障碍）和特殊面容的表型也一致，因此得到确诊；P13的8q24.22- q24.3有长达10.64 Mb的重复，至2岁龄时表现为孤立性语言发育迟缓。

尽管该CNV还没有明确的致病案例报导，然而8q24.3 2.3Mb的倒位重复与8q24.3微缺失均有导致多种发育迟缓的报道[12-14]，其中有重度精神运动发育迟缓、智力障碍、面部畸形和癫痫。

由此可见，8q24.22-q24.3，特别是8q24.3所关联表型的基因位点还有待进一步精确定位。

CNV-seq所能检测的理论最大分辨率为100 kb[10]。

本研究设置的阈值为200 kb及以上为阳性CNV，以减小假阳性误差，结果发现，致病性微缺失/微重复的片段大小均>1 Mb，而VOUS或良性CNV片段则有79.5% <1 M，表明CNV的大小与其致病性呈正相关，这可能是评估CNV致病性的依据之一，与捷克发育迟滞/智力障碍障儿童CNV研究发现一致[15]。

此外，与VOUS类别相比，致病性CNV中微缺失的频率是微重复的2倍（10 : 5），而在VOUS类中，微重复更为频繁。

这可能是由于对剂量敏感的单倍体基因来说，杂合性缺失的致病性往往比杂合性重复具有更高的致病性，并导致更严重的表型，这与大多数遗传性疾病为功能缺失（loss of function，LOF）而非功能获得（gain of function，GOF）变异的现象一致[16-17]，而对于微重复CNV，其引起的单个基因序列中断可能是致病的主要原因。

此外，本研究检出的VOUS共32例，占35.6 %（32/90），微缺失/重复共有42个，其中仅8个（19.05%）片段>1 M，并且这些微缺失/重复主要集中在3、4号染色体，这种CNV大小和分布的特征与表型的关联有待近一步研究阐明。

对于CNV检测阴性患者，应当联合其他基因检测技术，例如基于捕获的高通量测序技术panel或全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES），进一步寻找致病性点突变和小的插入/缺失。

本研究发现，发育迟缓患儿中合并表型主要包括特殊面容、先天性心脏病、孤独症谱系障碍、畸形等，致病性/可能致病性CNVs患儿中，特殊面容（10/18）是阳性率最高的表型，表明特殊面容（唇腭裂、眼距宽、耳位低、小下颌等）是判断其致病性的重要指标。

本组90例患儿通过染色体微缺失微重复片段，进行基因分析（ClinGen、DECIPHER、DGV等数据库），并找到可能与发育迟缓症状相关的候选基因（表1）。

与VOUS患者比较，两者的临床表型主要区别在于：致病性/可能致病性CNVs患者中，发育迟缓合并先天性心脏病、多发畸形/特殊面容及其他表型的患儿占78%（14/18）；而VOUS患儿中，合并其他症状者仅占40.6%（13/32）。

这表明含有许多基因或已知疾病基因的CNVs比含有很少基因或功能不确定基因的CNVs更有可能致病。

且大片段CNVs比小片段CNV 更易引起临床表型，因为它们的致病基因通常更多。

其中，VOUS患儿中合并ASD（2例）的频率要高于致病性/可能致病性患儿中合并ASD的频率[9]，表明合并有ASD的发育迟缓患儿CNV片段更加复杂，更难
表2 染色体核型异常及其相应 CNV-seq 检测结果
编号性别年龄核型分析CNV-seq检测结果(hg19)结果注释或参考案例是否能解释发育迟缓（核型/CNV-seq）
P1男8月47,XY,+mar dup(15)(q11.1q13.1)(8.92Mb)15q11-q13重复综合征否/是P9女7月47,XX,+13dup(13)(q12.11q34)13三体/Patau综合征是/是P10男7月47,XX,+21dup(21)(q11.2q22.3)21三体/唐氏综合征是/是P11女7月47,XX,+18dup(18)(p11.32q23)18三体/Edwards综合征是/是P12女1岁46,XX,del(11)(q13.5q21)del(11)(q13.5q21)(19.84Mb)多篇文献报道相关症状是/是P19男1岁45,XY,rob(13,14)dup(3)(p11.1)(0.48Mb)VOUS（ACMG）否/否P20女1岁46,X,t(X,11)(q11.2;p15.1)/否*/否
注：/ 阴性， *有待进一步检测证实其致病性
以解释其表型状况。

总之，CNV-seq作为一种基于高通量测序技术的基因检测方法，具有快速和便于与其他高通量基因检测技术联合使用的优势。

CNV-seq在发育迟缓疾病中的检测优势远远超过核型分析，在产前诊断甚至高危人群产前筛查中有广阔的应用前景，将能够有效降低儿童相关疾病的发病率和家庭社会的负担，对再次妊娠有重要的指导意义。

然而，由于正常人CNVs数据库还不完善，导致部分检测到的CNVs临床意义判断困难，还需要更多的病例报道及进一步完善的相关检查明确。

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（收稿日期：2020-06-23）
（本文编辑：蔡虹蔚）。