艰难梭菌毒素基因检测及分子流行病学分析

ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．０６．１０·临床实验研究·
艰难梭菌毒素基因检测及分子流行病学分析
李洋１ａ，姚立琼１ａ，刘志武１ａ，梁帅龙２，韦小宝２，刘旭升２，颉晓玲１ｂ（１．兰州大学第一医院ａ．检验科，ｂ．中心实验室，兰州７３００００；２．兰州大学第一临床医学院，兰州７３００００）
摘要：目的　了解腹泻患者艰难梭菌感染现状，并分析分离菌株的核糖体分型情况。

方法　收集１６１例住院腹泻患者粪便标本进行艰难梭菌毒素基因ＰＣＲ检测，同时进行产毒培养法，并比较２种方法的一致性；对分离的艰难梭菌进行核糖体分型。

结果　艰难梭菌产毒培养法阳性率为９．９４％（１６／１６１），粪便艰难梭菌毒素基因阳性率为９．９４％（１６／１６１），２种方法结果差异无统计学（Ｐ＞０．０５），一致性较好（Ｋａｐｐａ＞０．７５）。

培养所得１８株艰难梭菌中Ａ、Ｂ毒素基因均阴性的２株（１１．１１％），ｔｃｄＡ＋ｔｃｄＢ＋产毒株１５株（８３．３３％），ｔｃｄＡ－ｔｃｄＢ＋１株（５．５６％）。

１８株艰难梭菌核糖体分型分为１６种型别（ＧＳ１～ＧＳ１６），未发现核糖体分型
０２７型菌株。

结论　艰难梭菌粪便毒素基因ＰＣＲ检测可用于临床诊断，未发现本院艰难梭菌暴发流行。

关键词：艰难梭菌；毒素基因；核糖体分型
中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标志码：Ａ
ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅｔｏｘｉｎｇｅｎｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ
ＬＩＹａｎｇ１ａ，ＹＡＯＬｉｑｉｏｎｇ１ａ，ＬＩＵＺｈｉｗｕ１ａ，ＬＩＡＮＧＳｈｕａｉｌｏｎｇ２，ＷＥＩＸｉａｏｂａｏ２，ＬＩＵＸｕｓｈｅｎｇ２，ＸＩＥＸｉａｏｌｉｎｇ１ｂ（１．ａ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｂ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｅｎｔｒａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００；２．ｔｈｅＦｉｒｓｔＳｃｈｏｏｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｇａｎｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｓｔａｔｕｓｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ｉｎｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｄｉａｒｒｈｅａ，ａｎｄｓｔｕｄｙｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅｔｙｐｉｎｇｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｅｃｅｓｓａｍｐｌｅｓｏｆ１６１ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｄｉａｒｒｈｅａｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｏｒＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅｔｏｘｉｎｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｍｅｔｈｏｄｏｆｔｏｘｉｇｅｎｉｃｃｕｌｔｕｒｅ．ＴｈｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄＣ．ｄｉｆｆｉ
ｃｉｌｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｔｅｓｔｅｄｆｏｒｔｏｘｉｎｇｅｎｅａｎｄＰＣＲ ｒｉｂｏｔｙｐｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅｔｏｘｉｎｃｕｌｔｕｒｅｗａｓ９．９４％（１６／１６１），ａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆｔｏｘｉｎｇｅｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｆｅｃｅｓｓａｍｐｌｅｓｗａｓａｌｓｏ９．９４％（１６／１６１）．Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；ｔｏｘｉｎｇｅｎｅ；ｒｉｂｏｔｙｐｅ
艰难梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）是一种革兰阳性厌氧芽胞杆菌，可引起腹泻、伪膜性肠炎、中毒性巨
结肠甚至败血症等严重临床感染。

艰难梭菌毒素Ａ（ＴｃｄＡ）和毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）是该菌的主要致病因素［１］。

在欧美国家，艰难梭菌的流行已成为影响公共卫生的一大挑战，造成了严重的经济负担［２］。

艰难梭菌流行病学研究可采用ＰＣＲ核糖体分型（ＰＣＲ ｒｉｂｏ ｔｙｐｉｎｇ）、脉冲场凝胶电泳（ｐｕｌｓｅ ｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ ｒｅｓｉｓ，ＰＦＧＥ）、多位点序列分型（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｔｙｐｉｎｇ，ＭＬＳＴ）及序列测定等方法。

核糖体分型是欧洲艰难梭菌参比实验室分型标准方法，实验条件要
求低，经济实用，可快速判断艰难梭菌是否暴发流行。

在北美及欧洲地区多次暴发流行的核糖体分型０２７型产毒型艰难梭菌［３］，近年来在国内也有报道［４］。

本研究旨在了解本院腹泻患者艰难梭菌感
染现状，明确艰难梭菌产毒情况，同时对分离菌株进行核糖体分型，探讨菌株流行病学特点。

１　材料及方法
１．１　标本收集　收集２０１９年５月至１０月兰州大学第一医院１６１例住院腹泻患者（腹泻次数≥３
次／ｄ）的粪便标本，其中男性１０２份，女性５９份。

１．２　主要仪器与试剂　Ｓ１０００型ＰＣＲ扩增仪、Ｇｅｌ
ＤｏｃＸＲ凝胶成像仪（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司），ＶｉｔｅｋＭＳ基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（法国生物
梅里埃公司）；艰难梭菌选择培养基（ｃｈｒｏｍＩＤＴＭ
基金项目：甘肃省卫生行业科研计划项目（ＧＳＷＳＫＹ２０１８ ４２）。

作者简介：李洋，１９８９年生，女，主管技师，硕士，主要从事临床检验诊断研究。

通信作者：颉晓玲，副主任检验师，Ｅ ｍａｉｌ：ｗ２９３６１ｘ＠１６３．ｃｏｍ。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅａｇａｒ，ＣＤＩＦ）、哥伦比亚血琼脂平板、厌氧产气袋（法国生物梅里埃公司），粪便细菌基因组
ＤＮＡ提取试剂盒（天根生化科技公司），ＰｒｅｍｉｘＴａｑ酶、１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ（ＴａＫａＲａ公司）；引物
由南京金斯瑞公司合成；艰难梭菌标准株ＡＴＣＣ
４３２５５和ＡＴＣＣＢＡＡ １８７０由江苏省人民医院刘根焰教授惠赠。

１．３　细菌ＤＮＡ提取及毒素基因检测　用粪便细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取粪便细菌基因组
ＤＮＡ，依据试剂盒说明书进行。

参照文献中方法［５］用ＰＣＲ法检测毒素Ａ基因（ｔｃｄＡ）和毒素Ｂ基因
（ｔｃｄＢ）。

引物序列见表１。

反应体系共２５μＬ：
ＰｒｅｍｉｘＴａｑ缓冲液１２．５μＬ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ
８．５μＬ。

反应条件：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６２℃
３０ｓ，７２℃４５ｓ，３５个循环；７２℃７ｍｉｎ。

扩增产物经１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳成像观察。

表１　艰难梭菌毒素基因检测及核糖体分型引物
引物名称引物序列（５′→３′）产物长度（ｂｐ）ｔｃｄＡ ＦＧＣＡＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＧＴＧＧＴＡ６２９
ｔｃｄＡ ＲＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧ
ｔｃｄＢ ＦＣＣＡＡＡＲＴＧＧＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＡＣＡＧＧＴＧ４１０
ｔｃｄＢ ＲＧＣＡＴＴＴＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＧＴＡ
ＲＴ１６Ｓ ＦＧＴＧＣＧＧＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴ
ＲＴ２３Ｓ ＲＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＴＡＡＴＡＡＣＴＴＧＡＣＣ
１．４　艰难梭菌产毒培养法　粪便标本收集后立即接种于ＣＤＩＦ及哥伦比亚血平板，３５℃厌氧培养
４８ｈ。

选取ＣＤＩＦ上黑色、扁平、边缘不规则、具有特殊臭味的典型菌落，用ＶｉｔｅｋＭＳ系统鉴定。

培养阳
性菌株进行ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ检测，同１．３。

１．５　核糖体分型　参照Ｂｉｄｅｔ等研究［６］，用ＰＣＲ法扩增１６Ｓ～２３ＳｒＲＮＡ基因间隔区（ＩＴＳ），进行菌株分
型，引物序列见表１。

反应体系共５０μＬ：ＰｒｅｍｉｘＴａｑ缓冲液２５μＬ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各５μＬ，ＤＮＡ模板３μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１２μＬ。

反应条件：９５℃
５ｍｉｎ；９５℃１ｍｉｎ，５７℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃１０ｍｉｎ；７５℃４５ｍｉｎ。

扩增产物经３０ｇ／Ｌ
琼脂糖凝胶电泳成像观察。

以ＡＴＣＣ４３２５５和
ＡＴＣＣＢＡＡ １８７０（核糖体０２７型）作为对照菌株。

菌株核糖体分型结果聚类分析采用软件ＢｉｏＮｕｍｅｒ
ｉｃｓＢＮ７．５ｃｎ，相似系数采用Ｄｉｃｅ算法，位置差异容许度为１．５％，聚类算法选择非加权组平均法
（ＵＰＧＭＡ）。

相似度１００％认定为同一核糖体带型。

１．６　统计学分析　用ＳＰＳＳ２６．０软件进行。

艰难梭菌产毒培养法及粪便毒素基因检测结果进行配对χ２检验和Ｋａｐｐａ一致性检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

Ｋａｐｐａ系数≥０．７５，认为２种方法诊断结果一致性较好；Ｋａｐｐａ值＜０．４，认为２种方法诊断结果不一致。

２　结果
２．１　产毒株的筛查　１６１份粪便标本直接艰难梭菌毒素基因检测阳性率９．９４％（１６／１６１）；经培养鉴定
获得１８株艰难梭菌，经毒素分子检测，其中１６株检出毒素基因，分别为ｔｃｄＡ＋ｔｃｄＢ＋１５株（８３．３３％），
ｔｃｄＡ－ｔｃｄＢ＋１株（５．５６％）。

见图１。

配对χ２检验结果显示艰难梭菌产毒培养法与粪便毒素基因检测结果
差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），２种方法诊断结果一致性较好（Ｋａｐｐａ＝０．９３１）。

见表２。

注：Ｍ，１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ；１～５，ｔｃｄＡ；６～１０，ｔｃｄＢ；１、６，阴性对照（ｄｄＨ２Ｏ）；２、７，阳性对照；３～５、８～１０，患者标本。

图１　艰难梭菌ｔｃｄＡ及ｔｃｄＢ毒素基因ＰＣＲ电泳结果
表２　粪便毒素基因检测与产毒培养法结果比较
产毒培养法粪便毒素基因检测
阳性阴性合计
阳性１５１１６
阴性１１４４１４５
合计１６１４５１６１
２．２　菌株核糖体分型　对分离所得１８株艰难梭菌进行核糖体分型，共有１６种型别，命名为ＧＳ１～
ＧＳ１６，均为不同科室散发，未见聚集暴发病例，未发现０２７型菌株，见图２。

３　讨论
本研究中住院腹泻患者粪便艰难梭菌毒素基因阳性率为９．９４％，接近国内其他地区类似研究［７］，应
引起本地区临床及感染控制相关部门注意。

艰难梭菌为专性厌氧菌，传统分离培养鉴定困难且耗时，但厌氧培养敏感性高，菌株可用于流行病学调查［８］。

本研究选择ＣＤＩＦ显色培养基选择分离出可疑菌落，再结合ＶＩＴＥＫＭＳ快速、准确作出鉴定。

ＴｃｄＡ和ＴｃｄＢ是艰难梭菌的主要毒力因子，目前有多种商品化检测系统用于毒素基因检测，但需
要特定仪器，试剂成本较高。

本研究粪便标本基因组提取后ＰＣＲ检测Ａ、Ｂ毒素基因，耗时短，成本低，易于开展。

产毒培养法是艰难梭菌诊断的参考方法，用来评价其他检测方法。

本研究中粪便毒素基因检测结果与产毒培养法比较差异无统计学意义，一致性较好，表明粪便毒素基因检测方法可独立用于检测产毒素艰难梭菌。

同时采用２种方法可互补并增加检出率，其中１例ＰＣＲ毒素检测阴性标本培养后毒素检测为阳性，可能由于此粪便标本中艰难梭菌含量较少；而１例Ａ、Ｂ毒素阳性标本可能由于保存运输时间较长而未培养到菌株。

培养鉴定所得１８株艰难梭菌毒素基因检测结果显示，非产毒株ｔｃｄＡ－ｔｃｄＢ－占１１．１１％，ｔｃｄＡ＋ｔｃｄＢ＋产毒株占８３．３３％，ｔｃｄＡ－ｔｃｄＢ＋产毒株占５．５６％，表明本地区艰难梭菌感染中产毒株占优势，同相关研究结果一致［９］。

核糖体０２７型产毒型艰难梭菌曾在多个国家暴发流行，毒力作用大且易复发。

近年来，我国内地报道０２７菌株均为散发［１０］，未引起暴发流行。

本研究采用ＡＴＣＣ４３２５５、ＡＴＣＣＢＡＡ １８７０（核糖体０２７型）作为对照菌株，对１８株艰难梭菌进行核糖体分型，未发现０２７型高毒力菌株，同时也未发现院内聚集暴发流行。

图２　艰难梭菌核糖体分型聚类分析
４　参考文献
［１］ＢａｕｅｒＭＰ，ＮｏｔｅｒｍａｎｓＤＷ，ｖａｎＢｅｎｔｈｅｍＢＨ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆ ｆｉｃｉｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎＥｕｒｏｐｅ：ａｈｏｓｐｉｔａｌ ｂａｓｅｄｓｕｒｖｅｙ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，２０１１，３７７（９７５９）：６３ ７３．
［２］ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＣ，ＶａｎＢｒｏｅｃｋＪ，ＴａｍｉｎｉａｕＢ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｅａｒｌｙｈｉｓｔｏｒｙ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒａｉｎｔｙｐｉｎｇｍｅｔｈ
ｏｄｓ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂＰａｔｈｏｇ，２０１６，９７：５９ ７８．
［３］ＡｎｎｅＪ，ＴｒａｖｉｓＪ，ＫｉｅｒｒａＭ，ｅｔａｌ．ＰＣＲｒｉｂｏｔｙｐｅｓｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓｄｉｆｆｉｃｉｌｅａｃｒｏｓｓＴｅｘａｓｆｒｏｍ２０１１ｔｏ２０１８ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｒｉｂｏ
ｔｙｐｅ２５５［Ｊ］．ＥｍｅｒｇＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔ，２０２０，９（１）：３４１ ３４７．［４］ＣｈｅｎｇＪＷ，ＸｉａｏＭ，ＫｕｄｉｎｈａＴ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｆｉｒｓｔｔｗｏＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉ
ｃｉｌｅｒｉｂｏｔｙｐｅ０２７／ＳＴ１ｉｓｏｌａｔｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＢｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ ａｎｅｍｅｒ
ｇｉｎｇｐｒｏｂｌｅｍｏｒａｎｅｇｌｅｃｔｅｄｔｈｒｅａｔ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１６，６：１８８３４．［５］ＰｅｒｓｓｏｎＳ，ＴｏｒｐｄａｈｌＭ，ＯｌｓｅｎＫ．ＮｅｗｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅｔｏｘｉｎＡ（ｔｃｄＡ）ａｎｄｔｏｘｉｎＢ（ｔｃｄＢ）ａｎｄｔｈｅｂｉｎａｒｙｔｏｘｉｎ（ｃｄｔＡ／ｃｄｔＢ）ｇｅｎｅｓａｐｐｌｉｅｄｔｏａＤａｎｉｓｈｓｔｒａｉｎｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｎｆｅｃｔ，２００８，１４（１１）：１０５７ １０６４．［６］ＢｉｄｅｔＰ，ＢａｒｂｕｔＦ，ＬａｌａｎｄｅＶ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｅｗＰＣＲ ｒｉ ｂｏｔｙｐｉｎｇｍｅｔｈｏｄｆｏｒＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅｂａｓｅｄｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ
ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，１９９９，１７５（２）：２６１ ２６６．
［７］孔懿，金慧，姜亦虹，等．江苏地区医院艰难梭菌流行病学研究［Ｊ］．中华医院感染学杂志，２０１６，２６（１１）：２４２１ ２４２４．［８］徐英春，张曼．中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识［Ｊ］．协和医学杂志，２０１７，８（２）：１３１ １３８．
［９］程敬伟．艰难梭菌实验室检测、分子流行病学及毒力差异研究［Ｄ］．北京：协和医学院，２０１８．
［１０］ＺｈｏｕＹ，ＭａｏＬ，ＹｕＪ，ｅｔａｌ．ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄａｄｕｌｔｓａｎｄｔｈｅｆｉｒｓｔｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ
ＰＣＲｒｉｂｏｔｙｐｅ０２７ｉｎｃｅｎｔｒａｌＣｈｉｎａ［Ｊ］．ＢＭＣＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，２０１９，１９（１）：２３２．
（收稿日期：２０２０ ０３ ２０）
（本文编辑：周万青，刘群）。