RP-HPLC法测定清解合剂中绿原酸的含量

RP-HPLC法测定清解合剂中绿原酸的含量
摘要】目的建立清解合剂中绿原酸含量的测定方法。

方法高效液相色谱法。

采用Symmetry C18柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87)，检测波长为327nm。

结果本法线性关系良好，平均加样回收率为
99.29%。

结论本法简便、准确，可用于测定清解合剂中绿原酸的含量。

【关键词】高效液相色谱法清解合剂绿原酸
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）27-0059-02
Determination of Chlorogenic acid in Qingjie Mixtures by HPLC
Du Hui-min
(Taizhou Health Center & Hospital For Women And Children ,Taizhou 225300) 【Abstract】 Objective:To establish a HPLC method for the determination of Chlorogenic acid in Qingjie Mixtures.Methods:The Symmetry C18 column of
4.6mm×150mm，5μm was used .The mobile phase consisted of acetonitrile -
0.4%H3PO4 solution (13:87).The detective wavelength was 327nm.Results:The linearity of this method was well with the average recovery of 99.29%.Conclusion:The method is simple and accurate. It can be used for the determination of the contents of Chlorogenic acid in Qingjie Mixtures.
【Key words】 HPLC Qingjie Mixtures Chlorogenic acid
清解合剂是由金银花、黄芩、地丁、黄柏等7味中药加入适宜的附加剂，采
用适宜的方法提取、纯化、浓缩至一定体积制成的口服液体制剂。

是由丹阳市中
医院的协定处方开发研制的中药制剂，本品具清热解毒之功效，主要用于治疗疔
疮痈疖，无名肿毒，红肿热痛等阳症。

金银花是清解合剂的君药，绿原酸为其中
的有效活性成分。

为有效控制其内在质量，笔者参考有关文献[1]- [4]，建立了高
效液相色谱法（RP-HPLC法）测定清解合剂中绿原酸含量的方法。

本法操作简便，绿原酸峰与其他组分峰分离良好，结果准确。

1 仪器与试药
高效液相色谱仪：Waters2695/2996/Empower色谱系统。

绿原酸对照品（供含量测定用，由中国食品药品检定研究院提供，批号为110753-200413）；清解合剂（丹阳市中医院提供，250mL/瓶，批号：110214、110228、110306）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Symmetry C18柱（4.6mm×150mm，3.5µm）柱，流动相为乙腈-0.4%磷
酸溶液(13:87)，检测波长为327nm；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：
10μL。

2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品约9.60mg，用50%甲醇溶解于100mL容量瓶，并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为96mg/L的对照品储备液[12]。

2.2.2 供试品(样品)溶液的制备
精密量取样品5mL置于100mL量瓶中，加50%甲醇约15mL,超声30min，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，静置分层，精密取上清液（弃去初滤液，取续滤液），用0.45µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备
按清解合剂的处方，制备不含金银花药材的阴性样品，按供试品溶液的制备
方法制成相应的阴性样品溶液，进样10µL，记录色谱图，结果详见图1-3。

图1 绿原酸对照品溶液的高效液相色谱图
图3 空白阴性样品溶液的高效液相色谱图
2.3 线性关系考察
取对照品溶液（96µg·mL-1）经过0.45µm滤膜滤过后，通过系统全自动进样器，分别进
样2.5、5、10、15、20µL，在上述色谱条件下，测得峰面积。

以绿原酸的量为横坐标，峰面
积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。

得线性方程Y=3×106X-552631 r=0.9992（n=5），线
性范围为0.24～1.92µg
2.4 精密度试验
在上述相同色谱条件下，精密吸取同一对照品溶液10μL，重复进样5次。

RSD为0.5％
（n=5），精密度良好。

2.5 重复性试验
精密吸取同一批号的样品5份，按样品溶液制备方法平行制备样品。

再精密吸取以上溶
液10μL进样，在上述相同色谱条件下，对该样品进行测定。

RSD为1.1％（n=5），结果显示其重复性较好。

2.6 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10μL，按上述色谱条件，分别于0，2，4，6，8，10，24h各
进样1次，进行测定，计算RSD为0.4%。

结果表明，样品溶液在24h内稳定。

2.7 回收率试验
分别精密量取3ml、5ml浓度为0.91mg/mL的对照品溶液加入样品含量为2.13mg/mL的
清解合剂（江苏省丹阳市中医院自制，批号110306），按样品溶液制备方法制的样品5溶液份，在上述色谱条件下含量测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=5）
3 讨论
3.1 提取时间的选择
本实验结合相关参考文献[5]对最有提取时间进行了试验，结果显示：从10min到到
30min，随着提取时间的增大，色谱峰的面积也在呈不同程度的增大，但是30min以后，色
谱峰的面积并没有因为提取时间的加大而继续上升，以此，本实验选定提取30min。

3.2 提取溶剂的选择
本实验根据参考文献[6] -[8]选择了甲醇和乙醇进行比较，结果显示甲醇提取效果最好。

对不同浓度的甲醇之间也进行了比较，实验结果表明，选择50%的甲醇试剂提取色谱图中峰
分离度好，稳定性也好，能满足检测的要求，故选择50%甲醇为提取溶剂。

3.3 流动相的选择
本实验考察了甲醇-水-冰醋酸[9]、甲醇-乙腈-磷酸、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等流动相体系，结果表明乙腈-0.4%磷酸(13：87) 作为流动相，绿原酸峰形好，分离度好，无杂质峰干扰，故
最后决定采用乙腈- 0.4%的磷酸水溶液作为流动相系统。

3.4 检测波长的选择
经紫外分光光度计对绿原酸成分进行全波长检测，发现绿原酸在327nm处有最大吸收波长，再查阅相关文献，在该波长下，绿原酸响应值高，无干扰。

3.5 样品测定结果分析[10]
从测定分析结果看，该合剂的成分含量较好，但是由于原料生产地、原料投放量、生产
的试剂室的温湿度等不同可能会造成同一生产方不同批次中有效成分含量差异。

本方法简单、有效，能作为清解合剂的质量起到有效控制。

参考文献
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[2] 马柯.高效液相色谱法测定清咽颗粒中绿原酸的含量[J].中南药学,2006.4(6)：451-454.
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报,2007.13(3)：71-73.
[4] 陈苑林,叶芳.高效液相色谱法测定小儿清咽颗粒中绿原酸的含量[J].广州:中国中医
药,2009.7(10)：40-41.
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学院学报,2008.7(4)：10-12.。