基于DNA条形码技术的连云港基岩岸常见帽贝物种识别

ＸＷ１
ＸＷ６
ห้องสมุดไป่ตู้
ＸＷ１８
ＸＷ７
ＸＷ２０
１１（２９．７％）
０（０．０％）
７（１８．９％）
０（０．０％）
１９（５１．４％）
总数量 Ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒ
３７（１００％）
夏季 Ｓｕｍｍｅｒ 秋季 Ａｕｔｕｍｎ
１７（２５．４％） １８（３０．５％）
２（３．０％） １（１．７％）
１３（１９．４％） １１（１８．６％）
基于 Ｂｌａｓｔ结果，利用这 ５个种的代表序列 （样品编号为 ＸＷ１、ＸＷ６、ＸＷ７、ＸＷ１８，Ｘ Ｗ２０），结合 ＮＣＢＩ中 ２５条 ＣＯⅠ 基因序列（每个 种各 ５条序列），构成一个系统发生分析数据集 （图 ４），以此进一步佐证物种识别的结果。从系 统发生关系来看，本次识别的所有“真帽贝”均来 自笠贝科，“假帽贝”来自松螺科（Ｓｉｐｈｏｎａｒｉｉｄａｅ）。 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ计算结果显示，齿舌新笠贝（ＸＷ６）、笠 贝（ＸＷ１）、日本菊花螺（ＸＷ２０）的识别有着较 高的可信度（图 ４）。同时，本研究基于世界海洋 物种目录 数 据 库 还 进 行 了 图 片 检 索，结 果 发 现， ＸＷ２０的外部形态与该数据库中的日本菊花螺 有着较高的相似性（图 １，图 ５）。此外 ，ＸＷ１的
此外，随 着 社 会 经 济 的 发 展，沿 海 地 区 环 境 污染问题日益严重，世界各国对此采取了一系列 应对措施。其中，海洋环境污染的生物评价法是 了解污 染 水 平 的 有 效 手 段 之 一［８］。 而 帽 贝 因 其 自身特 点 已 成 为 重 要 的 污 染 评 价 指 示 生 物［９］。 据记载，中国沿海分布的真帽贝有 ２６种，其中， 中国大陆沿海的真帽贝物种主要分布于山东、浙 江、福建沿海［１０］。连云港地处中纬度，东临黄海， 具有江苏省唯一的基岩海岸（长约 ２２ｋｍ）［１１］，然 而，目 前 连 云 港 地 区 帽 贝 的 分 布 情 况 尚 不 清 楚 ［１，１２］，因此有必 要 对 连 云 港 地 区 沿 岸 分 布 的 帽 贝种类进行研究。由于同一种帽贝在形态上可
程序设 置 为：９４℃，３０ｍｉｎ；９４℃，４０ｓ，７２ ℃，１ｍｉｎ（５个循环）；９４℃，４０ｓ，４６℃，４０ｓ，７２ ℃，１ｍｉｎ（３０个 循 环 ）；７２℃，１０ｍｉｎ；４℃ 下 储 存。将 ＰＣＲ产物送至南京擎科生物科技有限公 司进行测序。 １．３ 物种识别
利用世界海 洋 物 种 目 录 数 据 库 （ＷｏＲＭＳ）比 对本实验采集的全部样本，并基于帽贝外壳的形 状、颜色、大小，挑取形态差异较大的样本进行基 于 ＤＮＡ 条 形 码 的 识 别。利 用 ＮＣＢＩ数 据 库 对 ＣＯⅠ 序列进行比对分析（Ｂｌａｓｔ）。在所有比对到 的序列中将相似度 ≥ ９９％ 的序列作为目标序 列，并采集这些序列进行系统发生分析。系统发 生分析采用 ＮＪ法，参数选择 ＭＥＧＡ软件的默认 值［１５］。
关键词：ＣＯⅠ ；多样性；ＤＮＡ条形码；帽贝 中图分类号：Ｑ３４９ 文献标志码：Ａ
世界海洋物种目录数据库（ＷｏｒｌｄＲｅｇｉｓｔｅｒｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ， ＷｏＲＭＳ） 将 软 体 动 物 门 （Ｍｏｌｌｕｓｃａ）腹足纲（Ｇａｓｔｒｏｐｏｄａ）物种分为 １０个亚 纲。然而，目前学术界对这些亚纲的分类与该数 据 库 并 不 完 全 一 致。 以 其 中 的 亚 纲 Ｐａｔｅｌｌｏｇａｓｔｒｏｐｏｄａ为例，该 数 据 库 中 按 “亚 纲”来 分，而在一些研究中仍按“目”来对待［１－２］。但较 为统一的是，学术界将属于 Ｐａｔｅｌｌｏｇａｓｔｒｏｐｏｄａ的物 种统称 为 “真 帽 贝”（ｔｒｕｅｌｉｍｐｅｔｓ），共 包 含 ４个 科，即帽贝科（Ｐａｔｅｌｌｉｄａｅ）、花帽贝科（Ｎａｃｅｌｌｉｄａｅ）、 笠贝科（Ｌｏｔｔｉｉｄａｅ）和无鳃笠螺科 （Ｌｅｐｅｔｉｄａｅ）［３］。 不属于 Ｐａｔｅｌｌｏｇａｓｔｒｏｐｏｄａ的其他类似真帽贝形态 的物种则被称为“假帽贝”［１，４］。
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海 洋 渔 业
２０２１年
能存在较大差异，仅基于形态特征的识别具有一 定的不确定性。因此，本研究主要利用 ＤＮＡ分 子标记（细胞色素 ｃ氧化酶 Ｉ，ＣＯⅠ ）对所采集的 帽贝进行鉴别［１３］，以期为连云港沿海帽贝物种的 分布研究补充资料，并为今后开展有关无脊椎动 物进化研究及环境污染评价等工作提供参考。
图 １ 样本采集的地理位置 Ｆｉｇ．１ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓｏｆｓａｍｐｌｉｎｇｓｉｔｅ
第 ３期
郑 霞，等：基于 ＤＮＡ条形码技术的连云港基岩岸常见帽贝物种识别
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表 １ ＰＣＲ体系配置情况 Ｔａｂ．１ ＭａｔｅｒｉａｌｓｕｓｅｄｉｎＰＣＲ
序号 Ｓｅｒｉａｌ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
２（３．０％） ０（０．０％）
３３（４９．２％） ６７（１００％） ２９（４９．２％） ５９（１００％）
冬季 Ｗｉｎｔｅｒ
１２（２８．６％）
０（０．０％）
３（７．１％）
０（０．０％）
２７（６４．３％） ４２（１００％）
总数量 Ｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒ ５８（２８．３０％） ３（１．４６％） ３４（１６．５９％） ２（０．９８％） １０８（５２．６８％） ２０５（１００％）
海 洋 渔 业
２０２１年
纹。ＸＷ７的样本仅发现了 ２个，明显比其他样 本要小（表 ２）。ＸＷ２０的样本贝壳内部有明显 的黑色光泽。从采样情况来看，ＸＷ２０及 ＸＷ１ 类帽贝较为常见，分别占样本总数的５２．６８％ 和 ２８．３０％；其次是 ＸＷ１８类帽贝，占比为１６．５９％ （表 ２）。由于 ＸＷ６类型与 ＸＷ７类型的帽贝 数量未达到统计学分析的基本要求，因此仅利用 独立样本 ｔ检验对其他 ３种类型帽贝进行了两两 间的形态 差 异 显 著 性 分 析，结 果 显 示，各 类 型 间 均不存在显著性差异（Ｐ＞０．０５）。 ２．２ ＤＮＡ提取与 ＰＣＲ扩增
１．２ ＤＮＡ提取及聚合酶链式反应（ＰＣＲ） 帽贝肌肉组织 ＤＮＡ的提取参照经典的酚氯
仿抽提 法［８］。 物 种 识 别 中 用 到 的 无 脊 椎 动 物 线 粒体 ＣＯⅠ 基因的通用引物为：上游引物，５′ＴＡＡＡ ＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡ３′；下游引物，５′ ＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＧ３′［１４］。扩增 体系设定为 ５０μＬ，见表 １。
１ 材料与方法
１．１ 样本采集与统计 由于江苏省连云港市的连岛东侧为旅游景
区（连岛景 区 ），人 为 开 发 程 度 较 高，而 连 岛 西 侧 基岩岸较 为 原 始，受 人 为 干 扰 较 少，因 此 本 研 究 以连岛西侧基岩岸作为采样点（图 １）。２０１６年 ３ 月—２０１９年 ５月，课题组按 ４个季节（春季：３—５ 月，夏 季：６—８月，秋 季：９—１１月，冬 季：１２—２ 月）分别在连岛西侧的基岩岸进行了帽贝样本的 采集，每个季节采集 １～２次。采集过程中，主要 采用样线 法，以 潮 上 带 外 缘 某 点 为 起 点，向 大 海 方向呈放射状样线采样。每次采样均从高潮退 潮开始采。 用 游 标 卡 尺 测 量 帽 贝 贝 壳 的 长、宽、 高。利用 ｐｙｔｈｏｎ３．８．３的 ｓｃｉｐｙ包进行组间形态 特征的差异显著性检验（独立样本 ｔ检验）。
文章编号：１００４－２４９０（２０２１）０３－０２７９－０９
基于 ＤＮＡ条形码技术的连云港基岩岸 常见帽贝物种识别
郑 霞，张梦秋，刘 军
（连云港师范高等专科学校，连云港市生物技术重点实验室，江苏连云港 ２２２００６）
摘 要：为揭示连云港基岩岸常见帽贝物种的丰富度，以细胞色素 ｃ氧化酶Ⅰ （ＣＯⅠ ）基因条形码为主要工 具，参考世界海洋物种目录数据库（ＷｏｒｌｄＲｅｇｉｓｔｅｒｏｆＭａｒｉｎｅＳｐｅｃｉｅｓ，ＷｏＲＭＳ），对连云港连岛西侧分布的帽贝 物种进行了识别。共识别 ４种帽贝，分别为：日本菊花螺（Ｓｉｐｈｏｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ）、笠贝（Ｌｏｔｔｉａｇｏｓｈｉｍａｉ）、齿舌新 笠贝（Ｎｉｐｐｏｎａｃｍｅａｒａｄｕｌａ）、圆锥拟帽贝（Ｐａｔｅｌｌｏｉｄａｃｏｎｕｌｕｓ）。其中，利用 ＣＯⅠ 条形码准确识别出 ３个物种：日 本菊花螺、笠贝、齿舌新笠贝（经与 ＮＣＢＩ数据库的序列比对，相似度均 ≥ ９９％）；借助 １６ＳｒＲＮＡ条形码可进 一步识别出圆锥拟帽贝。日本菊花螺与笠贝为该地区首次报道种。研究结果为连云港地区帽贝物种多样性 研究提供了重要的参考资料。
收稿日期：２０２０－０９－２１ 基金项目：江苏省高等学校自然科学研究面上项目（１９ＫＪＤ１８０００１）；江苏省“青蓝工程”；江苏省盐城生物资源研究 重 点 实 验 室 开 放 课 题 （ＪＫＬＢＳ２０１６００８）；连 云 港 师 范 高 等 专 科 学 校 青 年 优 秀 人 才 支 持 计 划 （ＬＳＺＱＮＸＭ２０１７０２） 作者简介：郑 霞（１９７６—），女，硕士，江苏连云港人，高级实验师，研究方向：海洋动物学 通信作者：刘 军，讲师。Ｅｍａｉｌ：ｂａｉｙｕｅｇｕａｎｇ＿５２０２＠１２６．ｃｏｍ
从上述 ５类帽贝中各选择 １～３个个体，均成 功提取总 ＤＮＡ。利用通用引物对其进行 ＰＣＲ扩 增，成功率均为 １００％，测序峰图单一，扩增获得 了 ６５０ｂｐ左右的序列（图 ３）。 ２．３ 物种识别及系统发生分析
利用 ＣＯⅠ 序 列 通 过 数 据 库 进 行 比 对 分 析 （Ｂｌａｓｔ），初步识别出这些帽贝隶属于 ４个属，共 ５ 个种，其中 ４种为 “真帽贝”，分别是圆锥拟帽贝 （Ｐａｔｅｌｌｏｉｄａｃｏｎｕｌｕｓ）、史 氏 背 尖 贝 （Ｎｉｐｐｏｎａｃｍｅａ
试剂 Ｒｅａｇｅｎｔ 上游引物 下游引物 １０×Ｂｕｆｆｅｒ Ｍｇ２＋ ｄＮＴＰ Ｔａｑ酶 模板 ＤＮＡ 纯水
加入量 ／μＬＶｏｌｕｍｅ １ １ ５ ３ １ １ ０．８
３７．２
２ 结果与分析
２．１ 帽贝的获得情况 本研究在 ３年内共采集 ２０５份帽贝样本。基
于帽贝的形态及贝壳颜色将其分为 ５种类型，分 别是 ＸＷ１、ＸＷ６、ＸＷ７、ＸＷ１８、ＸＷ２０（图 ２）。其中，类型 ＸＷ６的帽贝形态与其他帽贝差 异较大，表 现 为 其 贝 壳 近 乎 圆 形，而 其 他 帽 贝 都 为卵圆形。类型 ＸＷ１的样本，其贝壳内有一圈 白色的环，贝壳边缘分布有很粗的黑白相 间 的 条
ｓｃｈｒｅｎｃｋｉｉ）、齿舌新笠贝（Ｎｉｐｐｏｎａｃｍｅａｒａｄｕｌａ）、笠 贝（Ｌｏｔｔｉａｇｏｓｈｉｍａｉ），１种 是 “假 帽 贝 ”，为 日 本 菊 花螺（Ｓｉｐｈｏｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ）（表 ３）。与以往研究相 比，除日本菊花螺与笠贝在连云港海岸未见报道 外，其余 ３种均已有报道（表 ３）［１，１２］。本研究结 果为江苏连云港沿海海域帽贝的物种多样性提 供了新的记录。
表 ２ 各季节帽贝的采集数量和形态特征
Ｔａｂ．２ Ｓａｍｐｌｉｎｇｎｕｍｂｅｒｏｆｌｉｍｐｅｔｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅａｓｏｎｓａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
春季 Ｓｐｒｉｎｇ
样本数及形态特征 Ｓａｍｐｌｅｎｕｍｂｅｒａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
长 ／ｍｍ Ｌｅｎｇｔｈ
９．８７±１．１７ａ １８．５２±０．５９ ９．５２±０．２８ａ
帽贝 喜 欢 附 着 于 坚 硬 的 基 底，如 岩 石、贝 壳 等。该类物种通常具有类似“帽子”或“斗笠”形 状的外壳，其 作 为 腹 足 纲 物 种 中 最 原 始 的 种 类，
具有重要的研究价值［３］。比如，由于其分布广泛 （广泛的 生 存 适 应 性 ），且 兼 备 取 样 的 易 获 得 性， 帽贝已成为学者们研究生物适应性进化史与生 物分布变迁史的重要模型生物 。 ［５－７］
图 ２ ５种类型帽贝样本实物图 Ｆｉｇ．２ Ｐｈｏｔｏｓｏｆ５ｔｙｐｅｓｏｆｌｉｍｐｅｔｓ
注：ＸＷ１、ＸＷ６、ＸＷ７、ＸＷ１８、ＸＷ２０分别为 ５种不同类型的帽贝编号 Ｎｏｔｅ：ＸＷ１，ＸＷ６，ＸＷ７，ＸＷ１８，ＸＷ２０ａｒｅｓｅｒｉａｌｓｏｆ５ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓｏｆｌｉｍｐｅｔｓ
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