血药法测定小鼠口服给药阿司匹林的动力学参数

血药法测定小鼠口服给药阿司匹林的动力学参数
实验名称：血药法测定小鼠口服给药阿司匹林的动力学参数
实验目的：掌握阿司匹林血样的处理方法
掌握血药浓度-时间曲线的测定方法
掌握血药法测定药物制剂动力学参数的方法。

了解并学习常用作图软件，药代动力学参数计算软件（DAS软件）。

实验试剂与仪器：昆明种小鼠80只，雌雄各半。

阿司匹林泡腾片，眼科剪，眼科弯头镊，1.5ml EP管，5ml EP管，小鼠灌胃针，低温高速离心机（12000转），水杨酸标准品，阿司匹林标准品、蒸馏水，涡旋仪，乙腈，冰醋酸，双蒸水
实验内容与步骤：
动物分组：80只动物随机分为3组
（1）单独给予阿司匹林200mg/kg 26只
（2）灌胃给予西咪替丁（CYP3A4抑制剂）50mg/kg，45min 后灌胃给予阿司匹林200mg/kg 26只
（3）灌胃给予西咪替丁（CYP3A4抑制剂）100mg/kg，45min 后灌胃给予阿司匹林200mg/kg 28只
1. 小鼠的口服给药，摘眼球法采集血样
小鼠灌胃给予阿司匹林200 mg/kg，分别于给药前和给药后10min、30min、1h、2h、4h、8h、16h不同时间点摘眼球采血，每个点3只平行采样，血样置于1.5 ml EP管中，室温静止10min后，1200RPM离心10 min，吸取上层血清备用。

(让血液自由滴落，尽量不要沾壁，防止溶血)
2. 供试品制备
精密量取血浆样品150μl，加入乙腈850μl（作用为除去蛋白），涡旋振荡5min，10000 RPM离心8min，取上清液20μl进高效液相色谱检测。

记录色谱图、阿司匹林原型药物与其代谢产物水杨酸峰面积(As)，根据标准曲线计算血浆中阿司匹林与水杨酸的浓度。

3. 液相色谱条件
色谱柱：C18（4.6x150, 5 μm），流动相：乙腈-5%冰醋酸水溶液（20:80），检测波长为303 nm或275 nm.
4. 标准曲线制备
(1) 水杨酸标准曲线
分别取水杨酸40 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，得到 4.0 mg/mL水杨酸的贮备液，用乙腈分别稀释成不同浓度的系列溶液（4000、2000、800、200、80、20 μg/mL）（母液）。

取6支5 mL EP管，分别加入0.15 mL空白血浆，各支分别加入50 μL水杨酸系列溶液，再加入乙腈1.8ml，涡旋振荡5 min，15000 RPM离心8 min，得工作液水杨酸浓度分别为0.5、2、5、20、50、100 μg/ml。

取上清液20 μL用高效液相分析检测。

以As为纵坐标，水杨酸浓度C (μg/mL)为横坐标，直线回归，求算标准方程及R值。

(2)阿司匹林标准曲线
分别取阿司匹林40 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，得到4.0 mg/mL阿司匹林的贮备液，用乙腈分别稀释成不同浓度的系列溶液（4000、2000、800、200、80、20 μg/mL）（母液）。

取6支5 mL EP管，分别加入150 μL空白血浆，各支分别加入500 μL阿司匹林系列溶液，再加入乙腈350 μL，涡旋振荡5 min，15000 RPM离心8 min，得工作液阿司匹林浓度分别为10、40、100、400、1000、2000 μg/m L。

取上清液20 μL用高效液相分析检测。

以As为纵坐标，阿司匹林浓度C (μg/mL)为横坐标，直线回归，求算标准方程及R值。

5. 血样中药物浓度测定及血药浓度-时间曲线的绘制方法作图:
综合各组动物数据，每三个样本合为一组，计算其平均值及SD，按照在坐标纸上以血药浓度-时间描点作图。

同时学习常用作图软件（eg. GraphPad），学习用软件绘制时间-血药浓度曲线。

6. 根据血药浓度和动力学公式计算相关动力学参数
用线性回归法求出口服给药后阿司匹林的药代动力学参数（C max, t max, K, Ka, t1/2, CL），同时计算AUC0-t与AUC0-∞（积分法或梯形法）。

学习使用DAS软件计算各药代动力学参数。