猪IP-10蛋白真核表达载体的构建

关键 词
猪 Ｉ．Ｏ 白 重组质粒 Ｐ １蛋
表 达
文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ： １０ —７ ３２ １）２０ ０ —２ ０ ７ １３ （０ ００ —０ ５０ １ ． 总Ｒ ．２ ２ ＮＡ的 提 取 和 Ｒ － Ｃ ＴＰ Ｒ 使 用 Ｔｉｏ试 剂 采 用 一 步 ｒ ｌ ｚ
法 从 猪 脾 脏 中 提 取 总 Ｒ Ａ［ 并 且 使 用 特 异 性 引 物 合 成 Ｎ ，
Ｃ 类Ｅ Ｒ （ ＸＣ Ｌ ．谷氨酸一 亮氨酸． 精氨酸） 族 ，其特 异性受体 亚
为 Ｃ Ｒ 。 Ｉ．０ 要 由 Ｉ型 、 Ｉ型 干 扰 素 以 及 脂 多 糖 ＸＣ ３ Ｐ １ 主 Ｉ （ Ｐ ） 刺 激 成 纤 维 细 胞 、 角 蛋 白细 胞 、 单 核／ 噬 细 胞 、 Ｌ Ｓ等 巨 内 皮 细 胞 、Ｔ 胞 等 ３ 多 种 细 胞 分 泌 【 】 研 究 表 明 ，Ｉ． 细 ０ １。 ． ２ Ｐ １ 具 有 招 募 中 性 粒 细 胞 、促 进 多 种 细 胞 因 子 分 泌 、 抑 制 ０ 部 分 肿 瘤 生 长 等 多 种 生 物 学 作 用 ，特 别 是 能 作 为 趋 化 因 子 介 导 Ｔ ｌ 炎 症 反应 而 参 与 多 种 疾 病 的 发 生 ， 因 此 在 抗 ｈ型 感 染 免 疫 、 治 疗 自身 免 疫 性 疾 病 等 方 面 具 有 广 泛 的 应 用 前 景 】 而 且 血 清 中Ｉ．０ 水 平 与 乙 肝 、 系 统 性 红 斑 狼 。 Ｐ１的 疮 、 病 毒 性 心 肌 炎 等 疾 病 有 相 关 关 系 。 为此 应 用 Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ 技 术 从 猪 脾 脏 中 扩 增 了 编 码 Ｉ．０ 基 因 片 段 ， 并 将 其 克 Ｐ１的 隆 入 真 核 表 达 载 体ｐ ＤＮ ．中 ， 以进 一 步 探 讨 其 生 物 学 ｅ Ａ３１
２１ ０ ０年第 ２期 （ 总第 １７期 ） ５
试
试 验 研 究
猪 Ｉ ．Ｏ 白真 核 表 山 （ 山东农业大学动物科技学院 泰安 ２ １１ ） ７０８
根据ＧｅＢ ｎ ＿ 发表 的猪Ｉ．Ｏ 白的核苷 酸序 列设计 并合 成 １ 特异性 引物，采用Ｒ －Ｃ ｎ ａ ｋ－ ￣ － Ｐ １蛋 对 ＴＰ Ｒ方法扩增 出 目的片
中 图 分 类 号 ：Ｑ ２ ＋ ５２． ６
干 扰 素 诱 导 蛋 白 １（ ｔ ｆｒｎｉｄ ｃ ｌ ｐｏｅ ０ Ｐ ０Ｉ ｅ ｅｏ ． ｕ ｉ ｅ ｒｔｉ １ ，Ｉ． ｎｒ ｎ ｂ ｎ １） 又 名 Ｃ ０， ＸＣ趋 化 因 子 配 体 １（ ＸＣ １ ） 属 趋 化 因 子 ０Ｃ Ｌ ０ ，
１ ． 重 组 质 粒 的 构 建 Ｉ—０ 因 的Ｐ Ｒ 物 经 Ｐ 产 ．３ ２ Ｐｌ基 Ｃ 产 ＣＲ 物 纯 化 试 剂 盒 纯 化 后 ，和 表 达 载 体 ｐ Ｄ ｃ ＮＡ３１ ａ Ｈ 和 ．用Ｂ ｍ Ｉ Ｅ ｏ 双 酶 切 ，纯 化 回收 载 体 ｐＤＮ ．与 目的基 因 片 段 ｃＲＩ ｃ Ａ３１ Ｉ．０ 然 后 按 一 定 的 比例 在 Ｔ 连 接 酶 作 用 下 ， ｌ ℃ 连 接 Ｐ１， ４ ６ 反 应 过 夜 后 ， 转 化 感 受 态 大 肠 杆 菌 Ｂ ２ ， 涂 布 于 含 氨 苄 Ｌ１
青霉 素Ｌ Ｂ固体培 养基 ，３ ℃培 养 。挑 取单 克隆菌 落扩增 ７
培 养 ，提 取 重 组 ｐ Ｄ ． Ｉ一质 粒 以备 作 鉴 定 。 Ｃ Ｎ３１ Ｐ １ － １ ． 重 组 质 粒 鉴 定 和 测 序 用 上 一 步 提 取 的 重 组 质 粒 ．４ ２ 做 模 板 进 行 Ｐ Ｒ扩 增 鉴 定 以及 用 限 制 性 内切 酶Ｂ ｍ Ｉ Ｃ ａ Ｈ 和
２ 结果 分析
２１ 猪 Ｉ．０ ＮＡｆ Ｒ －Ｃ 扩 增 结 果 ． Ｐ １ ｍＲ ｌ ＴＰ Ｒ ｔ Ｊ
取５ ｌ Ｃ 产 物在１ ｐＰ Ｒ ％琼脂糖凝胶上 电泳后 ，发现 有１
对。
１１ 质 粒 载 体 和 细 胞 株 ．． １
菌 Ｄ Ⅱ ＢＬ １ 均 由 本 实 验 室 保 存 。 Ｈ５ 和 ２，
１１ 工 具 酶 及 主 要 试 剂 限 制 性 内 切 酶 Ｂ ｍ Ｉ ．． ２ ａ Ｈ 和 Ｅ ｏ Ｔ ｑ ＤＮ ｃＲＩ ａ Ａ聚 合 酶 、 反 转 录 酶 ＡＭＶ、Ｄ 、 ＮＡ片 段 纯
Ｅ ｏ 进 行 双 酶 切 鉴 定 。 将 经 鉴 定 为 阳 性 克 隆 的 重 组 质 ｅＲＩ
１ 材 料与方法
１１ 材 料 ．
粒 纯 化 后 ， 送 上 海 生 物 工 程 公 司进 行 Ｄ ＮＡ序 列 测 定 ， 测 序 结 果 在 ｗ ．ｃｉ ｌ ｎｈ ｏ ￣ 站 中 的Ｇｅ Ｂ ｎ 中 进 行 比 ｗｗｎ ｂ． ｍ． ． ｖ ］ ｎ ｉｇ ｎ ａｋ 表 达 载 体 ｐＤＮ ．、大 肠 杆 ｃ Ａ３１
段 ，将 扩增 产 物连 接 到表 达 载４ ｐ Ｄ ３１ ，进行 序 列 测 定和 分析 。结 果表 明， 所克 隆 的 目的基 因的核 苷 酸长 为 ￣ ｃ ＮＡ ．上 ￣
３ ２ ｐ，共 编 码 １４ 氨 基 酸 。 该 基 因 片段 与 已发 表 的 猪 Ｉ．０ 白基 因 核 苷 酸 序 列 同 源 性 为 １０ ， 氨 基 酸 同 源 性 为 １ｂ ０个 Ｐ１蛋 ０％ １０ ０ ％。 本 试 验 为重 组 猪 Ｉ．０ 白的 生 产 及 功 能研 究 奠 定 了基 础 。 Ｐ １蛋
活 性 及 其 在 疾 病 治 疗 中的 意 义 。
ｅ ＮＡ， 采 用 Ｒ －Ｃ Ｄ ＴＰ Ｒ方 法 扩 增 目 的 基 因 ， 反 应 条 件 为 ： ９ ℃预 变 性 ７ ｎ ４ ０ ，５ ℃３ ｓ ２ ０ ５ ｍｉ ，９ ℃３ ｓ ５ ０ ，７ ℃４ ｓ共 ３ 个 循 ０
环 ，最 后 ７ ℃ 延伸 １ｍｉ。 ２ ０ ｎ