酵母表达培养基介绍
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毕赤酵母表达的培养基配制［5］
2.1 LB（Luria－Bertan i）培养基：
Trypto n l％
YeastExtrac t 0.5％
NaCl l％
PH 7.0
制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌 20min。
可于室温保存。
用于培养pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Ze ocin25ug / ml。
2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：
Trypto n l％
YeastExtrac t 0.5％
NaCl 0.5％
PH 7.0
制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌 20min。
可于室温保存数月。
用于培养pP ICZαA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeoc in 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD （又称YEPD）
YeastExtrac t Pepton e Dextro se Medium，（YeastExtrac t Pepton e Dextro se Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）
Trypto n 2%
dextro se (glucos e) 2%
+agar 2%
+Zeocin100μg/ml
液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeoc in 100ug/ ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin培养基（YeastExtrac t Pepton e Dextro se Medium）：
yeastextrac t 1%
pepton e 2%
dextro se (glucos e) 2%
sorbit ol （山梨醇）1 M
+agar 2%
+ Zeocin100μg/ml
不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGY
Minima l Glycer ol Medium（最小甘油培养基）
（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml 的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。
2.6 MGYH
Minima l Glycer ol Medium + Histid ine （最小甘油培养基+ 0.004%组氨酸）
在1000m l的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。
2.7 RD
Regene ratio n Dextro se Medium（葡萄糖再生培养基）
（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700m l，高压灭菌；
2. 冷却后于45℃水浴；
3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。
4℃保存。
2.8 RDH
Regene ratio n Dextro se Medium + Histid ine （葡萄糖再生培养基+ 0.004%组氨酸）
在RD培养基配制的第三步中，在加入10m l的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。
4℃保存。
2.9 RD及RDH平板的制备
1. 将186g的山梨醇和15-20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；
2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；
3. 迅速制备平板。
4℃可保存数月。
2.10 RD及RDH的TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）
1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；
2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；
3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。
2.11 MD与MDH
Minima l Dextro se Medium +（Histid ine）最小葡萄糖培养基+（0.004 %组氨酸）
（含有：1.34%YNB；；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）
1. 100ml的10*YNB；2ml的500*B和100m l10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml 即可；
2. 如配制MDH，可在上述的M D中加入10ml的100*H即可；
3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。
4℃可保存数月。
2.12 SOC培养基：
Trypto n l％
YeastExtrac t 0.5％
NaCl 0.05％
Glucos e (1mol / L) 2%
121℃高压灭菌 20min，冷却后，4℃保存
2.13 MM培养基：
M9母液：64g磷酸氢二钠，15g磷酸二氢钾，2.5g氯化钠，5.0g氯化铵加1L水灭菌
取M9母液200ml加水700m l,加2ml1m ol/l已灭菌的硫酸镁，加100微升已灭菌的1mol/l氯化钙（可加可不加）。
注意硫酸镁和M9母液要分开灭菌不然会有沉淀。
在M9培养基基础上添加0.5%葡萄糖即为M M培养基。
2.14 BMGY /BMMY培养基：
酵母粉：1.0克，蛋白胨：2.0克，YNB：1.34克，0.1mol/L pH6.0(或者pH7.0)磷酸缓冲液，甘油：1.0毫升，加蒸馏水到100mL
2.15 BMM培养基，全称：Buffer ed minima l methan ol 即最小缓冲甲醇培养基，常用于表达分泌型蛋白的培养基。
配制：
100mMpH6.0磷酸钾 1.34%YNB 4×10-5%生物素0.5%甲醇
1. 灭菌700m l 水，
2. 冷至室温，加入下列：100ml1M pH6.0磷酸钾缓冲液, 100ml10×YNB, 2ml 500×B, 100ml10×M
3. 放置于4 度，可放2 个月
10×YNB （13.4%酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸）
溶解134g YNB于1000ml水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4 度。
或者用34g YNB （不含硫酸铵不含氨基酸），100g 硫酸铵进行配制，可放1年。
注意毕赤酵母在高浓度Y NB 下生长更好。
YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。
YEPD是不能代替BM GY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。
不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEP D中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。
摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。
BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。
配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。
YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YP D一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。
若时间过长，温度过高，可能导致YP D焦化。
glucos e和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。
颜色很深的话，基本不能使用了。
或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35mi n高压灭菌。
小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含Y NB的差）。
如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。
用无机盐进行大规模发酵，更省钱。
大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。
另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。
一个批次100h左右估计3－4瓶氧气。
关于Tryp tone和Pepto ne的选择：
1）用培养E.coli的T rypto ne替代P epton e对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的AH109,Y187之类表达酵母，根本就长不好．
2）Trypto ne和Pe ptone虽然都是营养胨，但营养成分不一样．即使是一般的表达酵母可以在Try ptone生长，生长状态也没有在Pep tone中好．但trypt one和p epton e就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用pepto ne的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB。
3）如果要求不高，一般使用也还凑合．尽可能的用P epton e，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌．
4）用含Pept one的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。
而改用Try ptone后，培养基颜色变得很浅，和LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。
invitr ogen说明书说pepton e的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入pept one 的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为pept one是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。
培养毕赤酵母,书上说BIO TIN储液是水溶液,但事实上BI OTIN很难溶于水,可以稍稍水浴加
热一下。
配制500×BIOTIN stocksoluti on（0.02％）有这么3种方案：
1）、懒人是将Bi otin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；
2）、急性子是将溶液配成0.02N的Na OH，就很容易溶解了；
3）、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vit aminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）。
所以肯定要加的。
附：无机培养基配方
BSM无机培养基：
85% H3PO426.7ml/L
CaSO4?2H2O 0.93g/L
K2SO418.2g/L
MgSO4?2H2O 14.9g/L
KOH 4.13g/L
甘油40g/L
PMT1 4.0ml/L
100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800u l氨水)或10g/L硫酸铵调p H5.0，氨水用于上罐调pH（便宜，方便）。
诱导表达前调pH6.0。
pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HS A 融合蛋白的最适pH。
BSM高压灭菌后再加4.0ml/L 过滤除菌的P TM1(微量元素)4.0ml/L 。
100%的500ml甲醇加6m l PMT1，用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。
PMT1（1L）配方：
CuSO4?5H2O 6.0g/L
KI 0.088g/L
MnSO4?H2O 3.0g/L
Na2MoO4?2H2O 0.2g/L
H3BO30.02g/L
CoCl2?6H2O 0.5g/L
ZnCl220.0g/L
FeSO4?7H2O 65.0g/L
Biotin 0.2g/L
浓H2SO4 5.0ml。