生物制药层析技术

流
AB C
D
出
组
分
浓
度
时间（或流出液体积）
料液(各组分)→层析柱分离→随流动相依次流出→进入检测器→响应信号
色谱图的纵坐标为检测器的响应信号，横坐标为时间或 流动相流出体积。
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2. 体积、时间
① 总柱床体积（Vt）：层析剂经溶胀、装柱、沉降，
体积稳定后所占据层柱内的总体积。
② 外水体积（Vo）：柱中层析剂颗粒间隙的液相体积
二、应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、
多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可
以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、
去热源和脱色。
三、原理
▪ 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，
每个颗粒犹如一个筛子。
▪ 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分
（一）平衡排除理论 ▪ 当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已
多次进出于填料的孔，达到平衡。
▪ 平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。
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（二）扩散分离理论
▪ 溶质分子在流经色谱柱的过
程中，在流动相和固定相之 间没有达到平衡，存在着流
速依赖性。
聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性 1．流速为0.65ml/min； 2．流速为2.0ml/min溶剂为甲苯
亲脂性，同时保留亲水性。 这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。
这种凝胶在pH＞2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为 溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿 时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的 化合物却有吸附作用 。
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国产Sephadex LH－20可用于分子筛层析、吸附层析和 分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、激 素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯 仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。
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（一）、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
▪ 商品名为Sephadex G类。 ▪ 交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。 ▪ 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联
剂，形成三维网状结构的高分子 化合物。
▪ 其交联度是通过交联剂的加量及
反应条件来控制的。
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交联葡聚糖凝胶的化学结构
葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比 及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越
的总和。
③ 内水体积（Vi）：溶胀后的层析剂颗粒网孔中的液
相体积的总和。
④ 基质体积（Vg）：干胶体积，是层析剂基质颗粒骨
架所占据的体积。 Vt = Vo十Vi＋Vg
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⑤ 洗脱体积(Ve)：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底 部的洗脱液中出现浓度达到最大值(洗脱峰最高点)时 的流动相体积。
⑥ 洗脱时间(或保留时间)(te)：从洗脱开始，某一成 分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值( 洗脱峰最高点)时的时间。
R = 2（te2﹣te1） （W1 + W2）
式中：
① te2 和te1—洗脱峰2和峰1的保留时间； ② W1 和W2 —洗脱峰1和峰2的峰宽。
R<1时，两峰部分重叠； R=1时，两峰有98%的分离； R=1.5时，两峰分离程度可达99.7%。
因此，一般用R=1.5作为两种组分完全分离的标志。
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层析技术
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李绍军
层析技术（chromatography）又称色谱技 术、层离技术等，是一组相关技术的总称。
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▪ 层析技术具有分离精度高、设备简单、操
作方便等优点，是当前获得高纯度产物最 有效的分离纯化技术。
主要内容
▪ 第一节 概述 ▪ 第二节 凝胶层析技术
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概述
▪ 1、层析基本原理 ▪ 2、层析技术分类 ▪ 3、层析操作过程中一些基本概念和参数 ▪ 4、层析系统的基本组成及基本操作
2、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内 部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；
3、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分 渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以 它们流出的时间介于二者之间。
凝胶过滤层析
凝胶基质 凝胶珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越 后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便 按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分 离的目的。
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四、凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
月以内）。
▪ 常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。 ▪ 干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，脱水
收缩，抽滤，用60~80℃吹干。
▪ 半缩法：
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（二）修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex)
（一）亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex） 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈
子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间 的孔隙，随着溶剂流动，首先流出 层析柱；
▪ 相对分子质量较小的物质可自由地
进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长， 移动速率慢而最后流出层析柱。
▪ 中等大小的分子在大分子物质与小
分子物质之间被洗脱。
▪ 这样，经过层析柱，混合物中的各
物质按其分子大小不同而被分离。
带网孔的 葡聚糖珠
2、稳定工作pH为2－10，强酸溶液和氧化剂会使交联 的糖苷键水解断裂。
3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 °C下40 min对 凝胶的结构和性能都没有明显的影响。
4、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中的一些带电 基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强 度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。
小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也 代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于 分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔 越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持 水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持 水10mL，依次类推。
颗粒内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。 其流经体积最小，等于外水体积V0。
▪ 最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以
自由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经体积是 外水体积与内水体积之和V0+Vi。
▪ 物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分
子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分排阻” 或“部分渗入”。流径体积Ve是全部外水体积 加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi
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3. 峰高、峰面积和峰宽 ①峰高（H）：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高。 ②峰宽(W)和半峰宽(W1/2):峰宽是通过色谱峰的拐点作切线
在峰底部的截距。半峰宽是洗脱峰高一半时的宽度。 ③峰面积(A):峰与峰底之间的面积称为峰面积。
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4. 层析柱的分离度
分离度(R)又称分辨率，是相邻两个洗脱峰保留时间之差 的2倍与色谱峰峰基宽之和的比值，表示式为：
Sephadex G
编号意义： 1、吸液量； 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围 蛋白质、多糖
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葡聚糖凝胶性能与编号的关系
42
葡聚糖凝胶（G类）的规格
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葡聚糖凝胶（G类）特点
1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。
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性质与特点
1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比 较稳定，可以多次重复使用。
N=5.54 (te/W1/2)2
H=L/N
理论塔板数越大或理论塔板高度越小，说明层析柱
分离效率越高。
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四、柱层析系统的基本组成及基本操作
1.柱层析系统的基本组成
层析柱+层析剂 上样洗脱系统 检测系统 收集系统
三通阀
泵
泵
流
料液
动
相
层
D
析
C
柱
B
检测器
A
收集器
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2. 柱层析的基本操作
① 层析剂选择和预处理 ② 装柱 ③ 平衡 ④ 上样 ⑤ 洗脱 ⑥ 检测 ⑦ 收集 ⑧ 层析剂再生和保存
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分配系数Kd ▪ 排阻系数：
▪ 当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 ▪ 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 ▪ 0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
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凝胶层析的特点
（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。 （2）分离效果较好，重复性高。 （3）分离条件缓和。 （4）应用广泛。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。
小分子进 入葡聚糖
珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙
流出
固定相（凝胶）
▪ 三维空间网状结构
小分子 样品
分子筛效应：
固 定
按分子大小不同,在凝胶
相
受到的阻滞作用有差异,从而
造成各组分在凝胶柱中的迁
移速度不同得到分离。
小分子 被延滯
较快流出
流 动 相
大分子
1、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随 流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度 快，所以首先流出；
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⑦ 死体积(Vm)：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从
开始洗脱到柱出口出现浓度最大值时流出的流动相体积 。其值等于外水体积加内水体积。
⑧ 死时间(tm)：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从
开始洗脱到柱出口出现浓度最大值所需的时间。其值等 于流动相流过层析柱所需的时间。
⑨ 调整保留时间(te –tm)： 保留时间扣除死时间的值。
（二）葡聚糖凝胶离子交换剂 在G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡 聚糖凝胶离子交换剂 。
如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex） 及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝胶离子交 换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非 特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶 、激素、多核苷酸等的分离纯化动分离理论 ▪ 红细胞在毛血细管中流动时比血浆流
得快。
▪ 较大的分子较先通过或绕过这个填料
颗粒，使溶质能按其大小进行分离。
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分离过程
▪ 三种不同分子量物质的混合
样品用某种规格的凝胶柱进 行分离。
▪ 样品加入，以水或其他溶液
进行洗脱，即得洗脱曲线 。
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分离过程
▪ 最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入
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第一节 概 述
一、层析基本原理
当含有被分离物质的料液流过层析柱时，由于层析剂 对各组分的阻滞力不同而使各组分分离开来（不同组分在 流动相和固定相分配不同）。
三通阀
泵
泵
流
料
动
液
相
层
D析 C柱
B
检测器
A
收集器
（a）层析系统基本组成
ABC D
流 出 组 分 浓 度
时间（或流出体体积）
（b）分离出组分峰图
5. 流速的表示法
流速有线性流速(cm/h)和体积流速(mL/min)。
它们之间的换算关系为： 体积流速（mL/mim）
= 线性流速（cm/h）×层析柱截面积（cm2）/60 。
▲在放大过程中应保持线性流速不变；而增加体积流速将 随层析柱截面积的增大而增加。
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6. 柱效
柱效是表达层析柱性能的重要参数，可用理论塔板数N 和理论塔板高度H来衡量。
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第一节 概 述
二、层析技术分类
➢按分离机理不同分 吸附色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 亲和层析 疏水层析
➢按流动相-固定相分 气-液色谱（GLC） 气-固色谱（GSC） 液-液色谱（LLC） 液-固色谱（LSC）
➢按固定相不同分 柱色谱 纸色谱 薄层色谱
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三、层析操作过程中一些基本概念和参数
1.色谱流出曲线( 色谱图)
5、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可以选择，一 般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨 率高。
6、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒 要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。
保存
▪ 保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。 ▪ 湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个
AB C D
流出 组分 浓度
时间（或流出体体积）
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第二节凝胶层析技术
▪ 1、定义 ▪ 2、应用 ▪ 3、原理 ▪ 4、凝胶的结构和性质 ▪ 5、凝胶层析的生产条件和操作 ▪ 6、凝胶层析的应用
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gel filtration chromatography,GFC 21
一、定义
凝胶层析（gel chromatography）也称： 分子筛层析 分子排阻层析 凝胶过滤 凝胶色谱等