5、15 基因工程--上下游技术

2 反转录PCR(RT-PCR)
用于直接扩增经反转录为CDNA的特定RNA序列的PCR 方法称为RT-PC方法。此方法敏感度极高,且简单易行。 目前许多公司设计了多种形式的RT-PCR试剂盒,使用 十分方便,例如"一步法RT-PCR试剂盒",利用 SuperScript逆转录酶和TaqDNA聚合酶的混合体系, 所有反应在一个试管内完成,灵敏度极高,只需0.1pg总 RNA便可扩增3.5kb的CDNA片段;"高温反转录-PCR 系统"采用热稳定型RNAaseH-反转录酶,可在70℃条 件下完成反转录过程,最长可反转录12kb的CDNA分子。
3 定量PCR
定量PCR主要分为DNA-PCR和mRNA-PCR定量两类。 DNA-PCR采用同位素或荧光等标记经电泳分离的PCR 扩增产物,进行自显影后根据底片的曝光强弱对模板 DNA进行定量。本实验需预先采用已知浓度的标准 DNA模板,在PCR扩增后测定放射性并绘制标准曲线,根 据标准曲线确定扩增产物量。mRNA-PCR需先经逆转 录获得CDNA后再进行PCR扩增,采取同DNA-PCR定量 的方法确定RNA数量,这种方法由于 现在测定DNA序列主要有两类方法： 1. Sanger等提出的酶法。 2. Maxam及Gilbert提出的化学降解法。
两种方法尽管大相径庭,但结果却是一致的。
20世纪70年代两种方法刚问世时,化学方法测序重 现率高,较易操作,只需高质量的化学试剂,因此为 多数研究人员所接受。而酶法需单链DNA模板和 特异的寡核苷酸引物及高质量的聚合酶,操作较复 杂。随着M13噬菌体和载体的发展,引物合成日渐 方便及测序技术的日臻完善,目前主要采用Sanger 等发明的酶法测序。
1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切
酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转 大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的 基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能， 其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其 中的(1)、(2)、(3)步骤属于上游阶段，在实验室完成。
6 多重PCR
在同一试管内加入多对引物,扩增同一模板的若干部位,
如基因某段缺失则电泳条带会有相应消失,多重PCR最
多可同时扩增12条区带。这种技术已用于地中海贫血
等疾病的基因诊断中。
7 免疫PCR
免疫PCR是一种检测PCR产物的ELISA方法,用于抗原
检测。采用PCR扩增的DNA分子代替ELISA中的酶以 放大检出信号,连接分子将DNA和抗体连接,因此可用 扩增的DNA量来反映抗原的量,从而显著提高检测抗原 的灵敏度。
1 聚合酶链反应
聚合酶链反应即PCR (polymerase chain reaction) 技
术,1983年由美国Mullis发明,是一种在体外快速扩增 特定基因或DNA序列的方法,该技术的发明对分子生物 学发展起到极大的推动作用,发明者获得了1993年度诺 贝尔化学奖。
1.1 PCR技术的基本原理
4 鉴定带有目的基因的克隆
从大量的细胞繁殖群体中,筛选出克隆有重组DNA分子
的寄主细胞。为了挑选出重组子,针对不同基因的表达 产物,采用各自特有的测活方法确定其生物活性;也可以 采用酶联免疫方法确定其抗原性;以目的基因为探针,通 过DNA杂交方法可以直接确定重组子。
5 目的基因的扩增及获得目的产物
一：基因工程技术主要内容
1. 获得具有遗传信息的目的基因
2. 选择基因载体获得重组DNA 3. 将重组DNA分子导入宿主细胞 4. 鉴定带有目的基因的克隆 5. 目的基因的扩增及获得目的产物
1、获得具有遗传信息的目的基因
1 鸟枪克隆法 2 人工合成目的基因 酶促方法 化学合成法 聚合酶链反应 (PCR)
1 反向PCR (inverse PCR,IPCR)
采用靶DNA片段无酶切位点的一种限制性内切酶,在靶
DNA片段两外侧一定位臵进行酶切,获得小于2~3kb的 DNA片段,进行自身环化连接,依特定靶DNA片段两端 外侧序列互补的原则设计一对引物,经PCR扩增后,通过 引物与5'端互补结合,使得靶DNA片段两侧未知序列被 扩增,扩增片段大小取决于酶切位点和靶DNA片段间的 距离。
培养克隆有目的基因的重组子,提取获得扩增的目的基
因以进行深入的研究。将目的基因克隆至适当的表达 载体,采用特定的方法将基因导入受体细胞,使其在新的 遗传背景下获得活性表达,从而得到人类需要的特定目 的物质。
二：基因工程上游技术的主要内容
1 聚合酶链NA双链分开,重复下一轮的循环反应,经过多
次循环后反应体系中双链DNA分子数,即一对引物结合位点间DNA片段的 拷贝数理论上可达2n 。
PCR反应主要分为3个部分进行
(1)模板变性 (2)退火 (3)延伸
上述3个步骤构成一个循环,每一循环的产物 将成为下一循环扩增的模板
(3)终延伸 72℃ 7分钟
循环1次
1.2 耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶 ：1988年Saiki等人将Taq
DNA聚合酶成功应用于PCR扩增技术。 Tth DNA聚合酶是由嗜热水生菌 Tli DNA聚合酶 PfuDNA聚合酶
Taq DNA poly-merase
Taq DNA聚合酶(Taq DNA poly-merase)是从嗜热水 生菌(Thermus aquaticus)中分离获得的,该酶基因全 长2496个碱基对,编码832个氨基酸,酶蛋白相对分子 量为9.4×104,在70~75℃活性最高,即或在95℃高温 仍具有活性,因此无需在每一循环反应中再加酶。在正 常反应条件下,经过25~30个扩增循环(即扩增倍数达到 106)后,Taq DNA聚合酶量便成为了反应进行的制约 因素,如需继续扩增,要将产物DNA样品稀释 1000~10000倍,作为模板再进行新的PCR扩增反应。 和其他聚合酶一样,TaqDNA聚合酶也是Mg2+依赖酶, 对Mg2+浓度十分敏感。
核苷酸链的3'-未端,从而导致DNA链的终止。
现在采用的链终止法是在加减法基础上发展起来的,加
减法的创新点在于:①在DNA聚合酶的作用下进行引物 延伸反应;②碱基特异的链终止;③采用聚丙烯酰胺凝胶
2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要
包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反 应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化 的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等 一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控 制等。上述(4)、(5)、(6)、(7)、(8)属于下游阶段。
DNA是双螺旋分子,在高温条件下双链会发生分离成为单链DNA分 子,DNA聚合酶以单链DNA分子为模板,在与待扩增DNA片段两端序列互 补人工合成的引物及4种脱氧核苷三磷酸的存在条件下,合成新的DNA互 补链,该链的起点取决于一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点。 两条DNA单链均可成为合成新互补链的模板,鉴于引物是依扩增段两端序 列互补原则设计的,因此每一条新生链的合成均起始于引物的退火位点,继 而沿相反链延伸,因此每条新合成DNA链均具有新的引物结合位点。当再
解释：双链DNA在90～95℃变性；再迅速
冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序
列上；然后快速升温至70～75℃，在Taq
DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延 伸。
下面是一个参考程序循环：
预变性 94℃ 4分钟，循环1次 (1) 变性94℃ 1分钟 (2)退火54℃ 1分钟 延伸 72℃ 1分钟 循环30次
4 DNA单链构象多态性PCR
DNA单链构象多态性是一种简单易行鉴定扩增DNA序
列变化的技术,1989年Orita等发现单链DNA在进行非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,迁移率与一级序列密切相 关,这表明序列的微小变化会极大影响其构象。这是一 种单链DNA凝胶电泳技术,根据形成不同构象等长DNA
单链在非变性聚丙酷胶凝胶电泳时迁移率的变化来检
基因工程 上、下游技术
定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入 载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或 细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在 工程菌内进行复制和表达。
基因工程药物制造的一般流程： （1）获得目的基因；（2） 组建重组质粒；（3）构 建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯 化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装
Sanger,Maxam和Gilber共同获得了1979年的诺 贝尔化学奖。
2.1 Sanger双脱氧链终止法
Sanger双脱氧链终止法由英国剑桥大学Sanger等于
1977年发明。 其基本原理是DNA聚合酶具有两种酶催化反应的特点: ①能够利用单链DNA作模板合成出DNA互补链;②能够 利用2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸作为底物,使之掺入到寡
Pfu DNA聚合酶
Pfu DNA聚合酶是从嗜热菌Pyrococcus furiosis中分 离得到的,称高保真耐高温DNA聚合酶,能够纠正PCR扩 增中发生的核昔酸错误。该酶比Taq DNA聚合酶及其 变体错误率低10倍,Pfu DNA聚合酶的超常纠错功能是 由该酶性质决定的,其他耐热DNA聚合酶与Pfu DNA聚 合酶合用可以部分降低错误率,但达不到单独使用该酶 的效果。然而Pfu DNA聚合酶扩增率低于Taq DNA聚 合酶,这是由于该酶具有3'→5'外切酶活性。
测基因的变异。
5 不对称PCR (asymmetric PCR)
不对称PCR是一种专用于制备单链DNA的不对称PCR技
术,这种方法使用两种浓度差100倍的引物,低浓度的称 为限制引物,在限制引物用尽前,PCR扩增产物为双链 DNA,其数量呈指数上升,经约25个循环限制引物用尽 只存在高浓度引物的条件下,PCR扩增产物为双链DNA 的一条链,数量呈线性增加,不对称PCR技术可用于DNA 序列测定。
1.3 引物设计
引物(primer)是指与待扩增靶DNA区两端序列互补 的人工合成寡核苷酸片段,包括引物1和引物2,引物 1称为Watson引物,是5'端与正义链互补的寡核苷 酸,用于扩增编码链或mRNA链;引物2称为Crick引 物,是3'端与反义链互补的寡核苷酸,用于扩增 DNA模板链或反密码链。PCR扩增成功的关键因素 之一是引物的设计,它将直接影响扩增产物的大小、 位臵及扩增区的Tm值。引物设计的目的是要在扩 增特异性和扩增效率间取得平衡。
2 选择基因载体获得重组DNA
在体外将含目的基因的 DNA 片段和具有自我复制功
能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接 , 获得 重组 DNA 分子。可以作为载体的主要有质粒、噬菌 体 (phage) 、黏粒 (cosmid) 、病毒载体等。
3 将重组DNA分子导入宿主细胞
采用特定的方法将重组 DNA 分子转移至适当受体细胞 (也称寄主细胞), 并与之同步增殖。被导入的受体细胞分 为两大类：第一类为原核细胞,目前常用的有大肠杆菌、 枯草芽 抱杆菌、链霉茵等。第二类为真核细胞 , 其中真 核微生物主要有酵母、丝状真菌等 , 此外为动物细胞、植 物细胞。另外也可以导人动物和植物体。 导人的方法主要有转化、转染等方法 , 此外也可采用电融 合、显微注射和基因枪等技术。
1.引物的长度一般以15~30bp为宜,两个引物与模 板DNA结合点间的距离决定了待扩段的长度。 2.GC含量和Tm,一般认为G+C含量在45%~55%较 好。 3.引物末端的核苷酸 4.引物与非扩增区的同源性 5.简并引物 6.嵌套式引物
1.4 PCR技术的新进展
1.反向PCR (inverse PCR,IPCR) 2.反转录PCR(RT-PCR) 3.定量PCR 4.DNA单链构象多态性PCR 5.不对称PCR (asymmetric PCR) 6.多重PCR 7.免疫PCR