pcr条件选择

首先要看你的条带是否清晰，虽然亮度不够但是清晰度应该高，没有拖尾没有非特异条带和引物二聚体，如果以上都没有，仅仅是目标条带不够亮的话，我觉得
你可以将25微升体积同比放大至50微升反应体系，相应的制胶的时候插孔槽用大梳子而不是小的那种。

还有很重要的就是你的核酸染料是什么？我用过几种核酸染料感觉还是EB亮度最好，虽然毒性大了点。

如果条带不够亮，还有拖尾、非特异条带、引物二聚体等问题，那就是你反应体系中需要优化。

1、出现非特异扩增可能是你的引物设计上特异性差或者引物浓度过高，Mg浓度或酶含量过高（适当改变Mg浓度从1mM到3mM，间隔0.5mM进行梯度试验，或者酶含量改变按0.5U为间隔梯度试验。

）2、如果出现拖尾，，要考虑引物特异性和模板纯度，另外循环数、退火温度以及Mg含量过高、dNTP过多等也可能造成拖尾。

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因长度为100～300bp时可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性。

①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

②退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱
基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值解链温度=4G+C＋2A+T
复性温度=Tm值-5～10℃
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃150核苷酸/S/酶分子
70℃60核苷酸/S/酶分子
55℃24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数循环次数决定PCR扩增程度。

PCR循环次数主要取
决于模板DNA的浓度。

一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。

设计引用有一些需要注意的基本原理：
①引物长度
一般引物长度为18~30碱基。

总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。

有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。

为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。

引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。

由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

②GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。

若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

③退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。

一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR 的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

⑤与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。

这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：/BLAST/。

选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。

BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。

将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。

如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。

最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。

可是使用BLAST还是有其不方便的地方。

因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。

如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。

在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。

⑥引物末端
引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。

3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

⑦引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。

一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

⑧为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。

很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。

以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。

a 添加限制性内切酶酶切位点
添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。

一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5’端还需要加2～3个保护碱基。

但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，Hind Ⅲ3个。

其中，在原核表达设计引物时还有一些小
技巧，大家可以参考：《原核表达之实验前的分析》。

里面一些规则是所有表达都通用的。

有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。

不过这种方法虽然方便但并不推荐。

有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。

一旦出现问题，分析起来更麻烦。

b LIC添加尾巴
LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。

用LIC 法制备的pET 载体有不互补的
12–15 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。

扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。

T4 DNA 聚合酶的3'→5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。

由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。

c 定向TA克隆添加尾巴
在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。

但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。

因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向”了。

d In-Fusion克隆方法
这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的，2004年在生物通可着实风光了一把，不但当选年度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。

此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。

只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。

这种方法特别适合大批量的转化。

这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响，欢迎大家发email推荐给生物通。

说不定你的推荐可以让它成为年度之星呢。

如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入NotⅠ的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远。

因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。

在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了
菌液PCR
1. 加煮沸的菌液，
2.菌液PCR作模版的时候加量比普通PCR要多点因为模版浓度太低，一般3-5微升（50微升体系）
3. 菌液PCR通常要的酶要多一点，因为相比DNA来说，杂质更多一些，先变性10min
缺点：可能有非特异性扩增（假阳性），
优点：菌液PCR最大的优点是省时省事，
总结如下：
1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）
选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物
如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R
或SP6+目的基因-F
pCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-R
pEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）
仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合
2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）
挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中
37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上
（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）
3.菌液的处理
无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）
提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉
我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸
4.pcr体系：无特殊要求
同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度
5.模板的量：1-2ul
未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）
6.退火温度：55-58°C
此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°
我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目
的条带
7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来
8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变性的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步。