拟松材线虫对黑松苗的致病性

拟松材线虫对黑松苗的致病性
张治宇,林茂松3,余本渊
(南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室,江苏南京210095)
摘要:测定来源于中国、日本、韩国、加拿大、挪威和法国的20个拟松材线虫种群对2年生黑松苗的致病力。

根据其致病力大小分为3类:第Ⅰ类致病力很强,致死率大于85%,RHS (相关寄主适生性)系数大于100,包括法国的1个种群和中国的3个种群;第Ⅱ类有较强的致病潜能,在环境适宜的情况下可能造成严重危害,这一类数量最多,包括中国的
11个种群和加拿大的1个种群;第Ⅲ类几乎没有致病力,其致死率和RHS 系数都是0,包括韩国的2个种群及日本和挪
威各1个种群。

试验证明法国BmFr 种群致死速度最快,致病力最强。

黑松苗在感染拟松材线虫后,用自然界水分胁迫和PEG 胁迫处理,结果表明,干旱胁迫能明显加快黑松苗死亡速度,且大大提高死亡率。

提示在高温干旱的年份拟松材线虫可造成松树的大面积死亡。

关键词:拟松材线虫;致病力;黑松;干旱胁迫
中图分类号:S432145 文献标识码:A 文章编号:10002030(2004)01004605
Pathogenicity of Bursaphelenchus mucronatus
on the seedlings of black pine
ZH ANG Zhi 2yu ,LI N Mao 2s ong 3,Y U Ben 2yuan
(K ey Laboratory of M onitoring and Management of Plant Diseases and Insects ,Ministry of
Agriculture ,Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095,China )
Abstract :T wenty populations of Bur saphelenchus mucrunatus collected from China ,Japan ,Canada ,K orea ,France and N orway were tested for pathgenicity to 22year 2old seedlings of Pinus thunbergii.The populations determined falls into three groups according to the pathogenicity.The strongest pathogenicity am ong them was observed in BmFr ,BmCG HH ,BmCF J2and BmCF J3.Their m ortality was m ore than 85%and RHS index was over 100.The second included 11populations from China and BmCan ,which had strong potential pathogenicity.Alm ost no pathogenicity was laid on the third group including Bm Jan ,BmK 1,BmK 2and BmH which were zero both in m ortality and RHS index.The duration of life of black pine seedlings was the shortest with BmFr population inoculation in the test.The re 2sults indicated that drought 2stress condition could significantly increase death speed and m ortality of the seedlings treated by PEG and no wa 2tering after inoculation with B.mucronatus.
K ey words :Bur saphelenchus mucronatus ,pathogenicity ,Pinus thumbergii ,drought 2stress
关于拟松材线虫的致病性问题目前还存在争议,以往的研究认为拟松材线虫不致病或致病力极弱[1～3]。

但近几年国外的研究表明拟松材线虫能破坏薄壁细胞,导致松树幼苗死亡[4],说明拟松材线虫有一定的致病力。

我们在国内非疫区许多病死的松树上,尤其是马尾松上也发现了许多拟松材线虫,所以进一步研究拟松材线虫对黑松及马尾松的致病性已成为当务之急。

为此,本研究测定了20个不同来源的拟松材线虫的分离物对2年生黑松苗的致病性。

收稿日期:20030414
基金项目:江苏省科技攻关项目(BE99359)
作者简介:张治宇(1974),硕士研究生。

3
通讯作者C orresponding author :林茂松(1949),博士,教授,主要从事植物病原线虫研
究。

E 2mail :linms @njau 1edu 1cn
南京农业大学学报　2004,27(1):46～50Journal o f Nanjing Agricultural Univer sity
1　材料与方法
111　线虫种群的来源(表1)
表1　供试线虫种群、来源和寄主
Table 1　Populations ,geographical origins and ho sts of Bursaphelenchus strains te sted
线虫种群
P opulation 来源Origin
　寄主H ost
线虫种群
P opulation
来源Origin 寄主H ost
BmCZZ 浙江舟山Zhoushan ,Zhejiang P.thunbergii BmC JX 江西Jiangxi ,China
P.massoniana BmCH N 湖南Hu ′nan ,China
P.massoniana BmCF J2福建邵武Shaowu ,Fujian P.massoniana BmCN J 江苏南京Nanjing ,Jiangsu P.massoniana BmCF J3福建邵武Shaowu ,Fujian P.massoniana
BmCWY 1江苏无锡Wuxi ,Jiangsu P.massoniana BmCan 加拿大Canada 3未知Unknown
BmCWY 2江苏无锡Wuxi ,Jiangsu P.massoniana BmFr 法国France 3
P.pinaster BmCWY 4江苏无锡Wuxi ,Jiangsu P.massoniana Bm Jan 日本Chiba ,Japan 3
P.thunbergii BmCYY 江苏仪征Y izheng ,Jiangsu P.massoniana BmH 挪威Hanestad ,N orway 3P.sylvestris
BmCSC1重庆南山Nanshan ,Chongqing P.massoniana BmK 1韩国K orea 3未知Unknown BmCSC2重庆南山Nanshan ,Chongqing P.massoniana BmK 2韩国K orea 3
未知Unknown
BmCG HP 广东惠东Huidong ,G uangdong P.massoniana BxCN J
江苏南京Nanjing ,Jiangsu
P.thunbergii
BmCG HH
广东惠州Huizhou ,G uangdong
P.massoniana
注:3线虫种群由他人赠送,其余均由本实验室分离。

3
P opulations were provided by foreign nematologists and others were is olated by ourselves.
Bm :拟松材线虫Bursaphelenchus mucronatus ;Bx :松材线虫B 1xylophilus
112　线虫的鉴定和培养
所获得的线虫分离物,用形态学和ITS 2RF LP (限制性片段长度多态性)相结合的方法进行鉴定[5]。

所有的分离物采用单异活体培养法在灰葡萄孢(Botrytis cinerea )上24℃培养7～14d 。

113　拟松材线虫对黑松苗的致病性试验
试验在南京农业大学校内进行,试验地为蔬菜地,黏土。

供试树苗为2年生黑松苗,由连云港苗圃提供。

树苗移栽后,待其生长稳定,选择大小一致的树苗采用人工皮接法接种线虫。

接种虫量为每株3000条,每个种群接种8株。

分别以清水、B 1cinerea 和BxC N J 作为对照,各接种5株。

从2000年6月接种后开始观察松树的发病情况,每隔5d 观察一次,记录发病级数。

松苗感染拟松材线虫后,其病级按徐福元等[3]方法进行划分,根据针叶褪绿、枯黄和变红分为5级:0级为正常;Ⅰ级为褪绿或部分针叶(1/4以下)变黄;Ⅱ级为1/2～3/4针叶变黄,1/4以下针叶变红;Ⅲ级为3/4左右针叶变红;Ⅳ级为针叶全部变红,死亡。

树苗死亡后去掉树皮和针叶,分离、收集线虫并计数。

感病指数=
∑(各级株数×级值)
×100/调查总株数×发病最重级的代表数值
114　干旱胁迫试验
供试树苗为2年生的黑松。

供试线虫种群包括Bm Jan 、BmCH N 、BmCSC1、BmCF J2、BmFr 和BxC N J ,每株接线虫3000条,每处理10株。

试验包括自然界水分胁迫试验和聚乙二醇(PEG 26000)干旱胁迫。

自然界水分胁迫试验设树苗接种后每天浇水、隔5d 浇水和始终不浇水3个处理,每隔5d 观察发病进展,记录发病级数。

PEG 胁迫试验在室内进行,以2年生整株黑松树苗为试验材料,将其放入盛有0、15%、25%和35%PEG 溶液的4个容器中。

接种拟松材线虫后,每隔2d 采用称重法计算树苗水分蒸发
率并记录发病结果[6]。

以清水未接线虫为对照(CK )。

115　相关寄主适生性分析
采用Braasch 等[4]提出的相关寄主适生性(relative host suitability ,RHS )系数计算方法,计算黑松对不同线虫种群的适应能力,并显示不同种群的致病力情况。

RHS 按下式计算:
RHS =(接种后松苗死亡率×死亡松苗每克分离线虫平均数)/1000
2　结果与分析
211　拟松材线虫对2年生黑松苗的致病性
试验结果表明拟松材线虫的致病性差异非常大。

供试的20个种群对2年生黑松苗的致病力总体上
・
74・第1期 张治宇等:拟松材线虫对黑松苗的致病性
分为3类:第Ⅰ类有很强的致病力,致死率大于85%,RHS 系数大于100,包括法国的BmFr 和中国的
BmCGHH 、BmCF J2和BmCF J3共4个种群;第Ⅱ类有较强的致病潜能,其致病力与环境条件关系较大,这一类数量最多,包括中国的BmCZZ 、BmCH N 、BmCWY 1、BmCWY 2、BmCWY 4、BmC N J 、BmCSC1、Bm 2CSC2、BmCGHP 、BmC JX 和BmCYY 等11个种群和1个加拿大种群BmCan ;第Ⅲ类几乎没有致病力,其致死率和RHS 系数都是0,包括日本的Bm Jan 、韩国的BmK 1和BmK 2和挪威BmH 种群(图1和图2)。

试验结束时清水对照和B 1cinerea 对照树苗均生长良好,BxC N J 对照树苗全部死亡。

图1　拟松材线虫对黑松的致死率
Fig 11　Mortality of P.thunbergii inoculated with
B 1mucronatus
图2　黑松感染拟松材线虫的RHS 系数
Fig 12　RHS index of P.thunbergi inoculated with
B 1mucronatus
(N ote :11CZZ;21CH N ;31CN J ;41CWY 1;51CWY 2;61CWY 4;71CYY;81CSC1;91CSC2;101CG HP ;111CG HH ;121C JX;131CF J2;
141CF J3;151Jan ;161K 1;171Fr ;181Can ;191K 2;201H ;211BxCN J ;221H 2O ;231B.cinerea )
212　拟松材线虫对2年生黑松苗的致死速度
线虫和寄主的相互作用结果不仅表现在寄主的死亡与否,而且还表现在致死速度上。

由表2可知,在11个种群中法国BmFr 种群接种14d 后第一株树苗死亡,再过12d 后树苗全部死亡,平均死亡时间是24d ,为致病力最强的种群。

而中国BmCYY 种群死亡历期为36d ,平均死亡天数为38d ,为11个种群中致病性较弱的种群。

同属第Ⅰ类的4个种群中,虽然它们的致死率都为100%,但是BmCF J3的死亡历期和平均死亡天数最长,其致病力相对较弱。

第Ⅱ类的7个种群平均死亡天数为25d 的3个种群中,BmCan 的致死率最高,为6215%;BmCGHP 和BmCSC1死亡历期最短,为14d ,根据寄主对病原物
的抗性表现,这种致病的差异应称为侵袭力(aggressiveness ),这说明两者侵袭力较强。

表2　不同线虫种群对黑松的致死速度
Table 2　Mortality speed of B.mucronatus to P.thunbergii
致病型Pathotype
Ⅰ
Ⅱ
BmCG HH
BmFr BmCF J2BmCF J3BmCWY 1BmCZZ BmCN J BmCG HP BmCSC1BmCan BmCYY 第1株树死亡时间/d
The first seedling death time
1414212428282521242434平均死亡时间/d
Average death time
2524243128333425252538死亡历期/d
Death phase
12
12
28
24
16
28
28
14
14
16
36
注:1)死亡历期:在一个实验处理中从第1株松树死亡到最后1株松树死亡所经历的时间。

Death phase :the time from the death of first
pine to that of last pine 。

2)平均死亡时间:指在一个实验中每1株松树苗死亡所需时间的平均值。

Average death time :the mean time of each pine seeding death in one treatment.
213　干旱胁迫试验结果
21311　自然界水分胁迫　由表3可知,对无致病力的种群Bm Jan 处理来说,每日浇水与不浇水影响不
是很大,都没有造成树苗的死亡。

对有致病潜能的拟松材线虫处理浇水与否影响很大,如BmCH N 和BmCSC1,每日浇水的发病指数为30%～35%,仅有1或2棵树苗死亡;而不浇水的发病指数为85%～95%,死亡树为5～7棵。

对有较强致病力的种群如BmFr 和BmCF J2,每日浇水能减缓树苗的死亡速度,
每日浇水的60d 树苗才死亡,不浇水的30d 左右树苗全部死亡。

由此可见,干旱年份拟松材线虫的致
・84・
南　京　农　业　大　学　学　报 第27卷
病力相对较强,可能引起黑松的大量死亡。

表3　黑松苗感染线虫后干旱与浇水对发病进程的影响
Table 3　E ffect of drought 2stre ss and watering on the pathogenisis development of black pine inoculated B.mucronatus 线虫种群
P opulation 处理
T reatment
感病指数/%　In fection index
1d 5d 10d 15d 20d 25d 30d 35d 40d 50d 60d 每日浇水W atering every day
00000000000Bm Jan
隔5d 浇水W atering 5days intervals 00000000000不浇水N o watering
0022581010101010每日浇水W atering every day
000510151824283535BmCH N
隔5d 浇水W atering 5days intervals 00102545557077828282不浇水N o watering
00122548628290909595每日浇水W atering every day
00007121822263032BmCSC1
隔5d 浇水W atering 5days intervals 05204048567272727272不浇水N o watering
05204862758790909090每日浇水W atering every day
005173045627582
92
92
BmCF J2
隔5d 浇水W atering 5days intervals 0103035507095100不浇水N o watering
01032426792100每日浇水W atering every day
00153552708290
9292100
BmFr
隔5d 浇水W atering 5days intervals 01730558087100不浇水N o watering
01635608292100每日浇水W atering every day
0123555728795100
BxCN J
隔5d 浇水W atering 5days intervals 01645627792100不浇水N o watering 01840608895100未接虫未浇水对照(CK )
N o watering and inoculation
0000
21312　PEG 胁迫试验结果　试验表明(表4),黑松苗感染拟松材线虫后,用不同浓度的PEG 处理,水
分蒸发率较对照明显加快,9d 时,水分蒸发率达25%左右,11d 时水分蒸发率达45%左右,针叶出现萎蔫褪绿现象;而此时清水接虫水分蒸发率仅为14%～18%,10d 后针叶才褪绿;清水未接虫处理,
表4　感染拟松材线虫后PEG 处理对树苗水分蒸发率的影响
Table 4　E ffect of different PEG drought 2stre ss treatments on the seedling of black pine inoculated B.mucronatus 线虫种群
P opulation PEG /%PEG concentration
水分蒸发率/%　W ater evaporation rate
1d 3d 5d 7d 9d 11d 13d 15d 20d 25d 30d Bm Jan
0000215416812111014102110
2810
3610
152154106141117181721143613Chl 32521951111101414211226154411Chl 35
31971614101816231428144416Chl BmCH N
0021151381411121416171623122810
1521881211101617221326144116Chl
254169181310181824164318Chl 3581712101810241631134414Chl BmCSC1
00116413811101214111811231430103610Chl
1521361410101416241832184411Chl
253188181310181426124014Chl 3571811101710251231154216Chl BmCF J2
00118616818121615171911241128104110Chl
153187121310191127144314Chl 2561810101610211228124512Chl 3591214102010281733124418Chl BmFr
002186181012141618122214281428104410Chl
152186141210181125174414Chl 2571611101610211428134316Chl 3581813101810241131114511Chl 未接虫对照(CK )
N o inoculation
021*******
3Chl :失绿Chlorsis
・
94・第1期 张治宇等:拟松材线虫对黑松苗的致病性
20d 后水分蒸发率仅为2%～5%。

应当指出,在PEG 胁迫下,Bm Jan 种群也加速了树苗的死亡。

这也进
一步说明感染拟松材线虫后,PEG 处理能更快地加速树苗死亡。

3　讨　论
本试验所测试的20个拟松材线虫种群的致病性存在较大差异,存在致病力很强的种群(如福建
BmCF J2),它对2年生黑松苗的致病力与松材线虫相当,但这些种群只占所收集种群数的1/5。

拟松材线虫种群的致病力与地理分布没有直接的关系,来自欧洲的拟松材线虫中既有致病力强的BmFr 种群又有无致病力的BmH 种群,同样在亚洲种群中也存在这种情况(如Bm Jan 和BmCF J2)。

试验采用RHS 系数来描述不同种群对不同寄主的致病力差异,这样更能说明线虫种群和寄主之间的关系,但是一般认为该指标较适用于2～3年生的幼苗,且接种量在3000～5000条,这样才能充分体现它们在不同寄主上的适应性。

本试验证明在干旱胁迫下,拟松材线虫能加快黑松树苗的死亡。

叶内过氧化物酶体含有活性较高的乙醇酸氧化酶,在氧参与下催化乙醇醛酸氧化为乙醛酸和过氧化氢。

同时叶内还有活跃的过氧化物酶,能把H 2O 2分解。

用PEG 处理后C AT 活性会降低,导致树体内H 2O 2积累,使树苗死亡[7]。

在PEG 胁迫下,由于PEG 和拟松材线虫的双重影响,使树苗内的过氧化物保护酶系统受到破坏,体内积累过量H 2O 2,加快树苗死亡,因此在PEG 胁迫下感染线虫的树苗死亡更快。

试验证实不同拟松材线虫分离物对2年生黑松苗的致病性差异较大,多数种群对其有一定的致病性,且与气候状况关系较大。

在自然情况下它们对成年黑松和马尾松的致病性如何还需要进一步研究。

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责任编辑:夏爱红
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