枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的异源表达及分离纯化

枯草芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达及分离纯化
摘要：以枯草芽孢杆菌（B.subtilis HN503）的基因组 DNA 为模板,运用PCR法克隆α-淀粉酶基因,并转化大肠杆菌进行异源表达。

SDS-PAGE鉴定产物及通过离子交换柱和凝胶层析分离纯化，PAGE进行纯度鉴定。

1．立项依据与研究内容
1.1项目的立项依据
1.1.1α-淀粉酶及其应用
α- 淀粉酶(α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中，其国际酶学分类编号为 EC.3.2.1.1，是一种重要的淀粉水解酶。

它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4 葡萄糖苷键,产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取，而工业中主要应用的是真菌和细菌α- 淀粉酶。

目前，α- 淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶[1]。

α- 淀粉酶在淀粉工业中的应用。

α- 淀粉酶现已广泛的应用于淀粉糖的生产, 主要用于淀粉的糖化和液化，其水解产物如葡萄糖和果糖有着高甜度，被广泛用于饮料工业中软饮料的甜味剂。

在冷饮制作中，由于淀粉糊具有老化的物理性质，低温静置会形成不溶性的硬性凝胶块，影响冷饮的质量及口感。

α-淀粉酶的加入，能很快将淀粉水解到糊精和低聚糖范围大小的分子,使料液粘度急速降低，流动性增高,从而保证了高淀粉冷饮的质量,使其在口感上更适合于人们的需要。

工业生产中, 淀粉的液化是将α- 淀粉酶先混入淀粉乳中，加热，淀粉糊化后进行液化[2-3]。

α- 淀粉酶在焙烤工业中的应用。

α-淀粉酶作为一种安全、高效的改良剂,多用于面制品行业,适量的α-淀粉酶可改良面包品质,用于面包工业[4]。

α- 淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大, 纹理疏松; 提高面团的发酵速度;改善面包心的组织结构, 增加内部组织的柔软度; 产生良好而稳定的面包外表色泽; 提高入炉的急胀性; 抗老化, 改善面包心的弹性和口感; 延长面包心储存过程中的保鲜期[5]。

α- 淀粉酶在除垢剂中的应用。

酶是现代高效除垢剂的成分之一，酶在除垢剂中最大的功能就是使除垢剂更温和无害。

1975 年, α- 淀粉酶开始用于洗衣粉中。

现在, 几乎 90 %以上的液体清洁剂中都含有α- 淀粉酶,而且其在洗碟机用洗涤剂中的应用需求还在不断的增加。

α- 淀粉酶造纸工业中的应用。

淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉，自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高，可以利用α- 淀粉酶部分降解淀粉来调节，从而提高纸品质量、增加纸品功能、提高生产效率和降低生产成本等。

α- 淀粉酶在啤酒酿造、酒精工业的应用。

耐高温α-淀粉酶是一种新型液化酶制剂,是发酵行业用量最大的酶类,其热稳定性是由蛋白质本身的热稳定性决定的,广泛应用于啤酒酿造、酒精工业中。

在啤洒酿造中添加α- 淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽, 使辅料增加, 成本降低, 特别在麦芽糖化力低, 辅助原料使用比例较大的场合, 使用α- 淀粉酶和β- 淀粉酶协同麦芽糖化, 可以弥补麦芽酶系不足, 增加可发酵糖含量, 提高麦汁率, 麦汁色泽降低, 过滤速度加快, 提高了浸出物得率, 同时又缩短了整体糊化时间。

80 年代末, 我国无锡酶制剂厂首先生产出耐高温α- 淀粉酶, 可使副原料比例从原来的 30 %
增加到 40 %以上, 实现了无麦芽糊化, 节粮、节能显著, 使啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高[6]。

酒精生产应用耐高温α- 淀粉酶, 采用中温95 ℃~105 ℃蒸煮, 既可有效地杀死原料中带来的杂菌, 降低入池酸度和染菌机率, 又可保护原材料中的淀粉组织不被破坏, 形成焦糖或其它物质而损失, 从而提高原料利用率[7]。

α-淀粉酶在医药工业中的应用。

为了弥补乳酸脱氢酶(LDH)、α-淀粉酶(α-Amy)、癌胚抗原(CEA)各单项检查在卵巢血清学诊断中灵敏度较低的不足,黄琛[8]将LDH、α-Amy、CEA三者进行了联合检测。

经临床试验证实:三者联合检测,以其中任意两项为联检阳性,均可提高卵巢癌的阳性检出率,并有助于卵巢癌与卵巢良性肿瘤的鉴别诊断。

邓淑丽等[9]研究唾液α-淀粉酶与致龋血链球菌粘附的关系,为龋病的病因学研究和预防提供了理论依据。

麦角隐亭是具有药理活性的生物碱,能用于治疗高血压和处理外周血管组织障碍。

用α-淀粉酶对淀粉的水解液作为碳源,发酵培养麦角菌ATCC20019,麦角隐亭产量较高。

黑曲霉α-淀粉酶因具有耐酸性,适用于制造助消化的药物,开发适合于胃酸性环境(pＨ2.0左右)的耐酸性α-淀粉酶,用于制备消化助剂,将会使医疗效果更为有效[10]。

1.1.2研究现状与立项依据
1.1.
2.1 提高α-淀粉酶产量与质量的意义
各种α-淀粉酶作为一种重要的工业用酶, 已经广泛应用于淀粉及淀粉基工业中, 且已经取得了很好的使用效果。

α-淀粉酶对缩短生产周期, 提高产品得率和原料的利用率, 提高产品质量和节约粮食资源, 都有着极其重要的作用。

但由于不同来源α-淀粉酶的性质上的差异, 导致了其应用受到一定的局限, 如耐高温α-淀粉酶在高温条件下才能发挥最大活力, 在低温和中温时其利用效率很低, 从而限制了其应用范围。

另外,不同α-淀粉酶应用于食品中, 其安全性有的尚未完全肯定。

因此，提高α-淀粉酶产量及质量有着重要的经济效益和对生产发展有着重大作用。

1.1.
2.2 大肠杆菌作为枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的异源表达系统的潜力与优势
大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌，学名称作“大肠埃希菌”，属于肠道杆菌大类中的一种。

它是寄生在人体大肠里对人体无害的一种单细胞生物，结构简单，繁殖迅速，培养容易，它是生物学上重要的实验材料。

大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉,可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[11],而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[12]。

1.1.3参考文献
[1]罗志刚, 杨景峰, 罗发兴.α- 淀粉酶的性质及应用[J].食品研究与开发，2007,28（08）：
163-166
[2] Gülay Bayramoglu, Meltem Yilmaz, M.Yakup Arica. Immobilization of a thermostable α-
amylase onto reactive membranes: kinetics characterization and application to continuous starch hydrolysis[J].Food Chemistry, 2004, 4(84): 591- 599
[3] 张力田.淀粉糖[M].北京: 轻工业出版社,1981:152- 154
[4] 张帅,刘永,黄广磊.α-淀粉酶对面包品质的改良[Ｊ].中国酿造,2008(8):42-43
[5] 孙晓云,王小生.α- 淀粉酶对面包品质的影响[J].食品工业科技,2005,11(26): 65- 67
[6]汪建国.酶制剂在酿造行业应用的研究及其发展前景[J].中国酿造,2004, 1:1- 4
[7]马福强. 耐高温α- 淀粉酶在酒精生产中的应用[J]. 酿酒科技,2001,3:42- 43
[8] 黄琛.血清乳酸脱氢酶、α-淀粉酶、癌胚抗原联合检测在卵巢癌诊断中的价值[J].华
中医学杂志,2000,24(3):167
[9]邓淑丽,韩曙光,陈晖等.应用α-唾液淀粉酶结合能力鉴定血链球菌[Ｊ].浙江预防医
学,2004,16(2):14-15
[10]陈远钊,罗俊成,胡佳,等.酸性α-淀粉酶菌株的诱变及酶的性质研究[Ｊ].中国酿
造,2007(1):10-13
[11] Nuc P,Nuc K.Recombinant protein production in Escherichia coli[J].Postepy
Biochem,2006,52(4):448-456.
[12] Dong X,Tang B,Li J,et al.Expression and Purification of Intact and Functional
Soybean(Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli[J].J Microbiol Biotechnol,2008,18(2):299-307.
1.2项目的研究内容
本实验的研究内容主要包括：
（1）枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因表达载体的构建：
枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆、连接载体、转化大肠杆菌、培养表达蛋白；（2）枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的分离纯化：
枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的提取、活性测定、分离纯化、鉴定纯度。

1.3研究方案
1.3.1基因的克隆与载体的构建
（1）枯草芽孢杆菌(B.subtilis HN503)总DNA的提取与检测：裂解细胞；试剂盒抽提；
琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）目的基因的克隆：根据枯草芽孢杆菌α-淀粉酶核苷酸序列, 以及表达载体上的多克隆位点设计上下游引物，以B.subtilis HN503的基因组 DNA 为模板, 用设计得到引物进行 PCR 扩增; 扩增条件: 94℃预变性 5min, 94℃ 1min, 54℃ 1min, 68℃2min, 30 个循环。

DNA 凝胶电泳检测 PCR 扩增产物, 将目的片段用试剂盒回收，并克隆到pMD19-T载体上，然后转入受体菌 E.coli DH5α中, 涂布于含有适当氨苄抗生素的 LB 平板, 37℃培养 12~16h 后挑取转化子, 筛选出含重组质粒的阳性克隆子 pMD19-Amy。

将克隆载体pMD19-Amy通过DNA限制性内切酶酶切和粘性末端连接将基因转移到表达载体上，构建相应质粒pET28-Amy。

1.3.2基因的表达与分离纯化
（1）DNA转化：制备大肠杆菌感受态细胞，加入质粒pET28-Amy，涂布于含有卡那霉素的LB 培养基, 筛选阳性转化子。

（2）蛋白表达：将筛选得到的转化子接种到新的含有卡那霉素的LB培养基，用IPTG诱导4h后进行SDS-PAGE电泳检测鉴定产物。

（3）酶活性测定与分离纯化：收集诱导产物进行超声破碎获得粗酶液，测定粗酶活性，经过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephadex G -75凝胶层析等步骤进行分离纯化。

（4）纯度鉴定：用PAGE鉴定纯化产物的纯度，如PAGE图谱出现单一条带即可得到电泳纯的α- 淀粉酶。

1.4可行性分析
1.4.1长期实验经验的积累
本人曾进行过铜绿假单胞菌fabI基因的克隆及功能鉴定的相关实验，掌握了基因的克隆及表达的实验操作。

另外，本人的毕业论文实验课题为“海芋过氧化氢酶的分离纯化及性质研究”，通过半年的实验操作，对酶的分离纯化及性质研究操作相当熟悉，为本项目实验的开展奠定了很好的基础。

1.4.2实验设计的合理性
本次实验设计中包括了SDS-PAGE对表达产物的鉴定、PAGE鉴定分离产物纯度等步骤，
能确保实验结果的准确性。

2．研究基础与工作条件
2.1工作基础
2.1.1课程学习
本人主修了的课程有：微生物生理学、基因工程、酶工程、生物化学、分子生物学、微生物等，掌握了扎实的理论基础。

2.1.2实验的积累
本人主修了的实验课程有：生物化学基础实验、生物化学实验技术、微生物生理学实验、微生物实验、基因工程实验等，掌握了熟练的实验操作技术。

本人已完成毕业论文实验“海芋过氧化氢酶的分离纯化及性质研究”并在广东省农科院甘蔗转基因实验的相关实习，对于基因的克隆、表达，酶的分离纯化技术较为熟悉，能独立进行实验。

2.2工作条件
2.2.1设备条件
2.2.2菌种资源
本人微生物生理学课程老师课题组收集和积累了丰富的细菌菌种和质粒载体，为本实验的开展提供了足够的实验材料。

与实验相关的主要细菌菌种和质粒载体如下:

（1）枯草芽孢杆菌：B.subtilis HN503。

（2）克隆和表达载体：pUC19、pET28b等。

（3）大肠杆菌受体菌：DH5α、BL21(DE3) 等。