灯盏细辛注射液对大鼠脑缺血／再灌注后海马区IGF—1表达的影响

灯盏细辛注射液对大鼠脑缺血／再灌注后海马区IGF—1表达的影响目的探讨灯盏细辛注射液对大鼠脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。

方
法成年雄性Wistar大鼠24只，应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立缺血2 h再灌注48 h模型，灯盏细辛注射液腹腔注射（3.6 mg/kg）干预治疗，苏木精-伊红（HE）染色观察海马神经元形态，TUNEL法检测神经元凋亡，免疫组化染色法检测IGF-1表达。

结果经灯盏细辛注射液干预后，胰岛素样生长因子-1（IGF-1）蛋白表达明显升高，海马神经元显著增加，细胞凋亡明显减少，大鼠认知功能明显改善。

结论灯盏细辛注射液可通过上调IGF-1的表达，有效地抑制细胞凋亡，改善学习记忆能力。

标签：脑缺血/再灌注；灯盏细辛注射液；IGF-1；神经元凋亡；认知功能障碍
胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）在成熟脑组织广泛低水平表达，对于神经细胞的正常生长、发育以及受损细胞的恢复有重要作用[1-2]，对中枢神经系统疾病具有治疗作用[3-4]。

许多研究发现[5-6]，脑缺血损伤后脑卒中IGF-1表达增强，IGF-1促进轴突生长和神经元存活。

灯盏细辛注射液（Fleabane injection）的主要成分是灯盏花素，能改善大鼠脑缺血神经功能损伤[7]，缩小脑梗死范围[8]，减少神经细胞凋亡数量[9]。

本实验试图观察灯盏细辛注射液对大鼠脑缺血/再灌注后神经元凋亡和IGF-1表达的影响以及认知功能障碍的作用。

1 材料与方法
1.1 大鼠脑缺血/再灌注模型
成年雄性Wistar大鼠24只，SPF级，4个月龄，体质量230～250 g，由青岛市药物检验所实验动物中心提供[（SCXK（鲁）20090007）]。

大鼠实验前置实验室环境适用1周，自由进食、饮水，室温（23±2）℃，自然光照，通风，术前禁食12 h。

随机分为假手术组（n=6），缺血/再灌注组（n=6），生理盐水组（n=6）和药物干预组（n=6）。

应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立缺血2 h再灌注48 h模型[10]，术后2 h出现左侧Hoener征，提尾时右前肢内收屈曲、爬行时向右侧划圈者为成功模型。

术中和术后以恒温电热器保持动物肛温36～37℃。

假手术组除不插线外，其余步骤同实验组。

1.2 治疗方案
灯盏细辛注射液（云南生物谷灯盏花药业有限公司，Z53021569）。

参照王羽等[9]报道的剂量，治疗组给予灯盏细辛注射液腹腔注射3.6 mg/kg，假手术组和模型组同步注射等量生理盐水。

1.3 评价指标
1.3.1 学习记忆能力治疗后采用MAZE-I Y型电迷宫（江苏省张家港市沙洲县三兴声电公司），参照Zhang等[11]报道的测定方法进行学习记忆功能测试，统计大鼠学习记忆错误反应频率，以百分比（%）表示。

1.3.2 苏木精-伊红（HE）染色治疗结束后，以100 g/L水合氯醛0.3 mL（300 mg/kg）腹腔注射麻醉动物，依次用0.9%等渗生理盐水250 mL、40 g/L多聚甲醛溶液250 mL经心脏灌注固定，断头取脑，置40 g/L多聚甲醛溶液固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。

脑组织常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、经石蜡包埋，连续冠状位切片（CM2027，Leica，Germany），厚度7 μm，贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，4℃保存备用。

每个标本取4张切片，常规脱腊水化，苏木精染色5 min，75%盐酸乙醇分化30 s，酸化伊红复染1 min，常規脱水、透明、中性树胶封片。

显微镜下观察海马神经元形态。

1.3.3 TUNEL法检测神经元凋亡取上述脑组织切片按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Stanta Cruz，美国）说明操作。

显微镜（Olympus CK2，Olympus，日本）观察，凋亡细胞核呈棕黄色染色为阳性，部分切片不加探针不出现阳性着色。

每个标本取4张连续切片，高倍镜下（400倍）随机选取海马区不重叠的4个视野计数炎性细胞，以（）表示。

1.3.4 免疫组化染色法检测IGF-1表达兔抗大鼠IGF-1单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（S-P）免疫组化试剂盒（北京中山生物技术有限公司），按试剂盒说明操作，DAB显色，细胞浆出现黄染为IGF-1蛋白表达阳性，部分切片不加一抗不出现阳性着色。

光镜下（400倍）随机取海马区4个不重叠视野计数阳性细胞，以（）表示。

1.4 统计学分析
实验结果采用SPSS15.0软件分析，实验数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 灯盏细辛注射液对大鼠学习记忆能力的影响
脑缺血/再灌注大鼠（每组6例）测试学习记忆错误反应率（4次，20.0%）较假手术组（1次，5.0%）和生理盐水组（1次，5.0%）明显增加（P＜0.05）。

药物干预后大鼠迷宫测试学习记忆错误反应率（2次，10.0%）明显减少（P＜0.05）。

2.2 灯盏细辛注射液对大鼠海马病理改变的影响
HE染色显示，假手术组海马神经元未见病理性改变，排列规整，细胞结构完整，核染色质着色均匀。

缺血/再灌注48 h及生理盐水对照组均发现海马神经元数目明显减少，细胞排列紊乱，部分神经元胞浆及核仁深染，变性细胞呈三角
形或不规则形，胞核浓染，部分神经元胞核丢失及胞浆缺失，呈空泡状。

药物干预后海马神经元排列规整，变性细胞数量明显较少，见图1。

2.3 灯盏细辛注射液对大鼠海马神经元凋亡的影响假手术组可见海马区海马轮廓清楚，细胞排列整齐，有少量的凋亡神经元（6.5±1.5个/视野）；缺血/再灌注损伤后神经元凋亡明显增加（30.5±5.5个/视野），呈弥散性分布，部分细胞皱缩；生理盐水组凋亡细胞减少（24.5±5.0个/视野），破碎细胞明显增多；药物干预后海马神经元凋亡数量（14.5±
3.5个/视野）明显减少（P＜0.05），见图2。

图2 大鼠海马CA2区凋亡神经元，TUNEL染色×200
2.4 灯盏细辛注射液对大鼠海马IGF-1表达的影响
假手术组海马IGF-1阳性神经元胞浆为广泛表达（25.5±4.5个/视野），胞浆颗粒呈黄染，细胞排列规整；缺血/再灌注组海马IGF-1阳性神经元呈弥散性分布（7.5±2.0个/视野），可见较多细胞裂解物；生理盐水组海马IGF-1阳性神经元分布紊乱，细胞数较少（8.5±2.0个/视野）；药物干预组海马IGF-1阳性神经元数量（17.5±3.5个/视野）明显增加（P＜0.05），细胞排列较整齐，见图3。

3 讨论
脑缺血再灌注可导致大鼠认知功能减退[12-13]。

本研究结果显示，脑缺血/再灌注组和生理盐水对照组大鼠学习、
图3 大鼠海马CA3区IGF-1表达，SP染色×200
记忆能力出现明显的认知功能障碍，海马神经元变性明显；而采用灯盏细辛注射液联合干预治疗对大鼠学习、记忆能力有显著的改善，海马神经元变性明显减轻。

海马神经元凋亡与认知功能减退关系密切[14]。

实验结果显示，灯盏细辛注射液能抑制脑缺血/再灌注后海马区神经元凋亡，大鼠认知功能明显改善，学习、记忆能力显著提高。

IGF-1對中枢神经系统疾病（如创伤性脑损伤）具有的治疗作用，可以减少神经细胞死亡数量，改善损伤后的神经行为功能[3-4]。

另外，经侧脑室途径注射IGF-1，可明显减轻大鼠缺氧缺血性脑损伤模型的病理改变，减少神经细胞凋亡数量[15]。

本实验结果显示，灯盏细辛注射液可通过促进海马神经元IGF-1蛋白表达，阻止海马神经元凋亡，改善脑神经功能，与有关报道相一致[9]。

综上所述，黄芪注射液与灯盏细辛注射液联合干预调控IGF-1蛋白的表达，是改善对大鼠脑神经功能损伤的机制之一。

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