重要动物组织切片制作技术

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7、选好组织块的切面
熟悉某些器官组织成分安排，然后决定其切面的走向；如一 长管状器官以横切面较好。
8、保持材料的清洁
组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生 理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。
9、切除不需要的部分
特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，否则给固定、 脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。
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（二）、固定的目的 1、迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与 腐败，使之尽量保持生前的状态与结构。 2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变 为不溶性物质，以保持其原有状态。 3、使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以 便染色后易于鉴别和观察。
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4、使组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程 中不易损坏。 5、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，经 染色处理后易于辨认。 6、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态 结构。 7、使组织块硬化，便于制作薄片。
称浸蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56℃， 在夏天较热时一般用高熔点石蜡，在冬天气温较 低时用低熔点石蜡，主要是有利于切片的制作。 时间不易过长，否则容易造成组织脆硬，时间不 足，也难制作良好的切片。
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四、 组织的包埋与包埋方法
组织块经过浸透剂浸透后，再用包埋剂（石蜡、 火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋。不同 的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成组织的 块。经过包埋后，可使组织达到一定的硬度和韧度， 有利于切成薄片。
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1、脱水剂 （1）酒精：是最常用的脱水剂，脱水能力强， 并能使组织硬化。其主要缺点是易使组织收缩、 变脆，故应勿直接用高浓度酒精，一般从70%酒 精开始；脱水时间勿过长。在70%可长时间保存。 （2）丙酮：脱水作用比酒精强，但对组织块的 收缩较大，价格较高，主要用于快速脱水或固 定兼脱水，脱水时间一般为1-3h左右。
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（一）、石蜡包埋法 石蜡包埋法为组织学技术中最常用的一种包埋
法。石蜡具有不同的熔点，夏天一般用50℃以上熔 点（硬蜡）石蜡包埋，冬天用50℃以下熔点（软蜡） 石蜡包埋，软的组织用软蜡包埋，硬的组织用硬蜡 包埋，一般常用的包埋熔点使52-56℃，如果需要 切4微米以下的切片，则用56-60 ℃的石蜡，较厚 的切片则用熔点为52-54℃的石蜡。新蜡必须在温 箱内溶化一次，以使其所含的挥发性物质蒸发，无 论新蜡和旧蜡都必须加热过滤后再包埋。
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（三）、注意事项及影响固定的因素 1、组织块不易过大，一般以厚度5mm，长宽不超过 15×15mm。 2、固定液的量一般以组织块大小的20倍为宜。 3、必须选择渗透力强，又不使组织过渡收缩或膨 胀的试剂作为固定液。 4、有的固定剂是由氧化剂与还原剂混合而成，如 甲醛（还原剂）与重铬酸钾（氧化剂）混合成的 Helly液等。
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（3）醋酸：亦名乙酸，能与酒精、水、氯仿等多 种试剂混合，故为许多混合固定液成分之一，其 穿透速度很快，固定小组织仅1h即可，对组织和 细胞有膨胀作用，且不能凝固细胞质中的蛋白质， 一般与引起收缩的固定液一起使用，以达到平衡 目的。
（4）苦味酸：苦味酸能沉淀蛋白质，对脂肪、类 脂无作用，渗透力较弱，很少单独使用，固定后 收缩明显，用含苦味酸的固定液固定组织一般不 宜超过24小时。
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（2）Carnoy液：冰醋酸一份，氯仿三份，无水酒精 六份。此液浸透速度快，固定时间不宜过长，小块 组织2-3小时即可，固定后直接入无水酒精脱水。常 用于糖原及尼氏体固定。一般固定时须放在冰箱中， 低温环境可明显减少收缩作用。
（3）中性甲醛液：最常用的固定液之一，配方:40% 甲醛120ml,蒸馏水880ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二 钠13g，pH7.0。
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（二）、石蜡包埋法包埋过程 组织块透明后，即可放入已熔的石蜡内浸蜡；
一般厚度约5mm的实质性器官，总的浸蜡时间约23h，均在恒温箱内进行。较理想的的浸蜡温度是石 蜡刚溶化的温度，或在蜡杯底部尚残留一小部分未 熔完蜡时的温度，浸蜡完成后，即做成包有组织的 蜡块。包埋蜡块的器材有专用的包埋框，也有自己 制作的包埋盒，只要是具有一定形状的容器，我们 都可以把它用作包埋盒。包埋的具体过程详述。
3、勿使组织块受挤压
切取组织块时刀剪要锋利，不要来回挫动，夹取组织时切 勿猛压，取材时组织块可稍大，以便固定后修块。
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三、 脱水与透明
（一）、脱水的意义与目的
组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不 能混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水，脱 水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。脱水时必 须由低浓度脱水剂开始，逐步转入高浓度脱水剂， 以防组织过度收缩而变形，或脱水不完全而影响制 片效果。脱水剂必须具有下列特性:脱水剂能与水 按比例混合；高浓度，一般指不含水分；脱水剂也 能与透明剂混合。
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二、 取材注意事项
1、材料新鲜
最好是动物心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器 的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕。
2、组织块力求小而薄
组织块的厚度以不超过5毫米为宜，较理想的厚度为2毫米 左右，主要目的是使固定液迅速而均匀不要来回挫动，夹取组织时切 勿猛压，取材时组织块可稍大，以便固定后修块。
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（3）氯仿：不易使组织变硬变脆，但透明能力比 二甲苯差，用作透明剂时，多用于大块组织的透 明（1cm），而且在容器内放置无水硫酸铜。 （4）其他透明剂：四氯化碳、苯甲酸甲酯和水杨 酸甲酯、香柏油（皮肤、子宫、肌肉和肌腱）、 松油醇、丁香油、冬青油与苯胺油和火棉胶包埋 的媒浸液等。
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3、浸蜡 组织经透明后，在溶化的石蜡内浸渍的过程
（4）中性缓冲甲醛液：为免疫组织化学最常用的固 定 液。固定时间 24h为宜 ，配方： 40%甲 醛 10ml， 0.01mol/LpH7.4的PBS90ml
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第二章：固定后处理及切片
一、 洗涤与修切
1、水洗法
一般常用流水冲洗，凡用含铬或锇的固定液固定的组织块， 必须用流水冲洗24h左右。常用的固定液为10%的甲醛水溶 液，也必须用流水冲洗，一般时间也为24h左右，固定时间 长的标本，冲洗时间也应延长。
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4、尽量保持组织的原有形态
新鲜组织经固定后，或多或少产生收缩现象，为此可将组织 展平，以尽可能维持原形。
5、要熟悉取材部位
要能准确的按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的 胰腺尾部；肺应取有细支气管及带有软骨片的小支气管部。
6、动物品种的选择
如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜 铺片为佳，欲观察运动终板，可用小鼠的肋间肌等。
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5、固定时间的长短视固定剂的不同要求而定， 也与气温、组织块的大小有关。温度高时则时 间缩短，组织块过大则应延长固定时间。 6、软组织或较大组织可先经2-3小时固定后再 修整成小块重新投入新配制的固定液内继续固 定。 7、特殊要求的组织，常需要特殊的固定液，所 以，取组织之前应做好准备。如各种神经组织 因显示内容不同，需不同的固定液与固定方法。
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3、常用混合固定液 （1）Bouin液：饱和苦味酸水溶液：75ml；甲醛 水溶液（40%）：25ml；冰醋酸：5ml。三者在 配方中的实际比例为1：5：15，为实验室常用 固定剂，其渗透力强，对组织固定均匀且收缩 较小，染色效果好。冰醋酸固定染色质，苦味 酸使组织适当硬化，甲醛水溶液调节两种试剂 对组织的膨胀作用。其固定时间以12-24h为宜。
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2、透明或媒浸
（1）二甲苯：是最常用的常规透明剂，它对组织 的收缩性强，易使组织变硬变脆，在二甲苯中一 般30min即可使组织透明，组织块可先经过无水 酒精-二甲苯混合液处理，再浸入二甲苯。也常 用于切片染色后透明，且不会使染料退色。
（2）苯和甲苯：对组织收缩性较小，与二甲苯相 比不易使组织变脆，但透明速度慢且挥发快，适 用于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透 明。
2、酒精洗涤法
凡含苦味酸或酒精的固定液固定的组织块，大多采用酒精 洗涤，如苦味酸影响着色，但易溶于70%酒精。
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二、 取材注意事项
1、材料新鲜
最好是动物心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器 的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕。
2、组织块力求小而薄
组织块的厚度以不超过5毫米为宜，较理想的厚度为2毫米 左右，主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。
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（3）正丁醇和叔丁醇：正丁醇是无色液体，脱 水能力较弱，可和水、酒精和石蜡互溶，因此 这种脱水的组织块可直接浸蜡和包埋。叔丁醇 是目前常用的一种脱水剂，它不易使组织收缩 或变硬，且脱水后不经透明直接浸蜡，电镜标 本制作时常用作中间脱水剂。 （4）其余脱水剂：还可以用作脱水剂的有：异 丙醇、还氧己烷、四氢呋喃、环己酮和松脂醇 等，但由于某些原因，现在都不常用。
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（7）铬酸：铬酸能沉淀蛋白质，适用于核蛋白的 固定，并能增强核的染色能力，穿透速度慢，一 般组织块的固定，需经12-24h，硬化程度中等， 收缩显著，除用作固定液外，万分之一的铬酸水 溶液，可制作分离标本。 （8）丙酮：丙酮能使蛋白质沉淀，渗透力强，但 对核固定欠佳，且使组织剧烈收缩。广泛用于组 织化学中酶的固定，其作用基本与酒精相同。 （9）三氯醋酸：作用与醋酸相似，很少单独使用， 在混合固定液中对组织起膨胀作用。
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（5）重铬酸钾：其穿透速度快，对组织收缩小并 稍有膨胀，重铬酸钾常备水溶液为3-5%。其混合 固定液，如Zenker液、Helly液及Regaud液等被 广泛用于组织学，凡经重铬酸钾、铬酸、铬酸盐 固定的组织，必须以流水冲洗后方能转入脱水剂。
（6）锇酸：锇酸一般只用于某些特殊染色或电镜 切片染色或固定，配制时要用洗涤干净的玻塞棕 色瓶，最好用双蒸水配制，锇酸穿透力弱，且易 使组织硬脆，因此它固定的组织必须小而薄，体 积最好在3×3×2mm以内。
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2、单纯固定液 （1）酒精：既是配制混合固定液的基本成分， 又可作为单纯固定液使用。用于固定时以80%95%浓度为好。缺点是经酒精固定的组织容易变 硬，对组织收缩较大。 （2）甲醛水溶液：常用的甲醛水溶液即市售的 福尔马林，常用浓度为10%，指以10ml的商品甲 醛（37%-40%甲醛水溶液）加入90ml水配成的， 此液实际上只有4%的甲醛。
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3、击头法
如大、小鼠，可用重物击头后部或将其头后部猛撞桌沿，最 好一击而死。
4、断头法
青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其头部，较大动物如 兔子等，可用斧头迅速砍头致死。
5、股动脉放血法
动物经吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。 注意：上述各法，应根据制片需要选用，如空气栓塞法不宜 用作血管注射标本的制作；乙醚麻醉对丘脑下神经部分泌物 染色标本不利；股动脉放血法有利于肠系膜铺片的制作。
动物组织标本制作技术
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第一章：取材及固定
一、 动物致死法
1、麻醉法
可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或有 盖玻璃瓶内进行麻醉；也可用4%戊巴比妥作静脉注射，剂量 按动物体重1ml/kg；或用20%氨基甲酸乙脂作腹腔注射，剂 量一般按动物体重5ml/kg。
2、空气栓塞法
如家兔可用50ml注射器将空气由耳静脉推入，使动物很快 死亡。
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（四）、固定液 1、固定液种类：一类是单纯固定液，即只有一种 试剂；另一类是混合固定液，由两种或两种以上试 剂组成。
作为较好的固定液，应有下列特性，首先，有 强渗透力，能迅速的渗入组织内部；其次，不使组 织过渡收缩或膨胀，并能使组织内欲观察的成分得 以凝固为不溶性物质；最后，能使组织达到一定的 硬度并获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的 亲和力。
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三、 组织固定法
（一）、固定的方法
1、小块组织固定法：从人体和动物取下的小块组织，立即 置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛最经常的方法。 2、注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液 极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定。这时 宜采用注射固定法，将固定液注入血管，经血管分支到达整 个组织和全身，从而得到充分的固定。 3、蒸汽固定法:比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醛蒸汽 固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。