副猪嗜血杆菌黑龙江株的分离与鉴定

副猪嗜血杆菌黑龙江株的分离与鉴定
李雪松;陈欣;符芳;王伟;田华彬;郎越坤;徐春红;李曦;李春艳
【摘要】为确定黑龙江某猪场发病猪群的病原,本研究从疑似浆膜炎的病料中分离到一株革兰氏阴性细小杆菌,通过对其进行细菌形态学、培养特征、生化特性和16S rRNA基因PCR鉴定,结果表明该分离菌株为副猪嗜血杆菌(HLJ-1分离株).16S rRNA基因序列分析结果显示:该分离菌株与参考株的基因同源性达99%;药敏试验结果表明HLJ-1分离株对头孢曲松、头孢噻肟等β-内酰胺类抗生素高度敏感;小白鼠致病性试验结果显示,该分离株具有较强致病性.%A small polymorphic gram negative bacterium was isolated from affected pig in Heilongjiang area. The bacterium was identified as Haemophilus parasuis (HLJ-1) by bacteria morphology, cultural character, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene PCR. Result revealed that 16S rRNA gene of HLJ-1 isolate shared the homology of 99％ with reference strains. Drug sensitive tests showed that HLJ-1 was highly sensitive to β-lactam antibiotics, such as Ceftriaxone and Cefotaxime, and less sensitive to polymixin B, but resistant to Phytomycin. Furthermore, pathogenic test in mice indicated that HLJ-1 isolate was a highly virulent.【期刊名称】《中国预防兽医学报》
【年(卷),期】2011(033)003
【总页数】3页(P236-238)
【关键词】副猪嗜血杆菌;分离鉴定;16S rRNA基因
【作者】李雪松;陈欣;符芳;王伟;田华彬;郎越坤;徐春红;李曦;李春艳
【作者单位】东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;哈尔滨师范大学,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030
【正文语种】中文
【中图分类】S852.61
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪格拉泽氏病(Glasser's disease)的病原，属巴氏杆菌科嗜血杆菌属，NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌[1]，可引起猪的多发性浆膜炎和关节炎。

近年来，由该菌直接感染或混合感染给养猪业带来一定的经济损失，已成为猪的主要病原之一[2]。

研究表明，HPS血清型复杂，目前已知有15个血清型，然而有15.2%～41%的分离株血清型不能确定[3]，根据日本、德国、美国和西班牙等国的血清流行病学调查，以血清型4、5和13最为流行[4]。

目前HPS在我国普遍流行，但尚未进行深入系统的研究。

本研究从黑龙江地区某规模化猪场分离得到一株革兰氏阴性细小杆菌，通过对其形态学和分子生
物学鉴定为HPS，命名为HPS HLJ-1分离株。

1 材料和方法
1.1 病料从黑龙江某猪场采集9份患浆膜炎病猪病料(包括肺脏、心包积液、关节
液和脑组织等)，临床症状表现为呼吸困难、气喘、消瘦、跛行等；剖检病变主要
表现肺脏出血点、胸膜炎等。

1.2 培养基与试剂胰大豆琼脂(TSA和TSB)培养基购自美国BD公司；NAD购自
上海生物工程公司；马血清购自Thermo公司；TSA和TSB培养基中各加入1
μg/mL的NAD和10%的马血清；药敏纸片、微量生化鉴定管购自杭州天和微生
物试剂有限公司；金黄色葡萄球菌及HPS血清5型标准菌株(Nagasaki株)16S rRNA阳性重组质粒为本室保存。

1.3 病原菌分离培养及镜检将病料匀浆处理，划线接种于含NAD的TSA培养基上，37℃、5%CO2初代培养48 h后观察细菌生长情况，挑取疑似单个菌落，进行纯培养。

将可疑单菌落涂片进行革兰氏染色后观察细菌形态。

1.4 分离菌株培养特性及生化特性鉴定取纯化分离菌株单菌落分别接种于普通琼
脂平板、麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板和含NAD鲜血琼脂平板上，37℃培养
24 h～48 h，观察细菌生长情况。

取纯化后的单菌落，接种于无绵羊鲜血平板上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃培养24 h～48 h，观察是否出现“卫星生长现象”及有无溶血现象。

挑取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落纯培养物分别接种于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、甘露糖、H2S、氧化酶、触酶、脲酶、吲哚、硝酸还原等已加入NAD的微量生化鉴定管，观察试验结果。

1.5 分离菌株16S rRNA PCR鉴定及测序根据文献[5]报道的HPS 16S rRNA引物进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'下游引物：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'。

预期目的片段长度为822 bp，反应体系25 μL，反应条件：94℃ 5 min；94℃
30 s、59℃ 30 s、72℃ 1 min，共30个循环；72℃10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察。

回收PCR产物并克隆至pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞中，由上海Invitrogen公司测序。

将测序结果与GenBank相关基因进行同源性
比较。

1.6 分离菌株小鼠致病性试验及药敏试验将分离菌接种于含NAD的TSB培养基
中于37℃培养至对数期后作为供试菌液。

洁净级昆明鼠分为3组，每组5只，处理如下：试验组1，腹腔注射0.3 mL供试菌液(活菌数约3×107个)；试验组2，腹腔注射0.3 mL供试菌液(活菌数3×106个)；对照组，腹腔注射无菌TSB液体
培养基。

隔离饲养一周后，观察接种小鼠的发病及死亡情况，并对发病小鼠进行剖检，脏器做动物回归试验。

将分离菌株的TSB培养物均匀涂布于含NAD鲜血琼
脂平板，待稍干后，将各种药敏纸片分别平贴于培养基表面，37℃培养24 h后测量抑菌圈直径。

判断标准：无抑菌环为不敏感，抑菌圈直径小于10 mm的为低度敏感，10 mm～15 mm的为中度敏感，15 mm以上的为高度敏感。

2 结果与讨论
2.1 病原菌的分离及形态学观察和生化鉴定结果病料样品在含NAD的TSA琼脂平板上经培养出现针尖大小、无色透明、圆形、边缘整齐、光滑湿润的露珠样菌落；革兰氏鉴定为阴性细小杆菌，具有多形性。

分离株在普通琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板上均未生长；在含NAD鲜血琼脂平板上长成露珠状、透明菌落，无溶血现象，分离菌具有“卫星现象”生长特性。

将细菌纯培养物接种于含NAD 微量生化鉴定管中，37℃培养(表1)。

鉴定结果与蔡旭旺等的研究结果相一致[6]，符合HPS的生化特性，将其命名为HPS HLJ-1分离株。

2.2 分离菌株16S rRNA的PCR鉴定及测序结果根据HPS 16S rRNA序列经PCR 扩增的产物约为800 bp(图1)。

HLJ-116S rRNA基因扩增产物测序结果为822 bp，与预期扩增结果一致，对其进行BLAST分析显示与HPS参考株16S rRNA
序列同源性达99%。

2.3 分离菌株小鼠致病性试验及药敏试验结果试验组15只昆明小鼠均于24 h内
死亡，其肺脏出血、水肿；肝和小肠坏死，其他组织无异常变化，从肺脏、脾、心血中分离到HPS。

试验组2和对照组小鼠观察7 d未见异常。

分离菌株HLJ-1药敏试验结果显示菌株HLJ-1对头孢曲松、头孢噻肟等高度敏感(表2)。

小鼠致病性试验证明HLJ-1分离菌为强致病株。

药敏试验结果表明，该菌对β-内酰胺类抗生
素高度敏感，这与文献报道一致[7]。

HPS血清型复杂，且不同菌株对同一种抗生素的敏感性有较大差异，临床用药应
结合分离菌株的药敏试验结果指导下进行。

目前已知的HPS有15个血清型，由
于各地流行的血清型不尽相同，且各型之间缺乏交叉保护，使得研制具有高效交叉保护力的疫苗有较大难度[4]。

目前预防与治疗仅限于抗生素和灭活疫苗的使用[8]。

虽已上市多种灭活苗，但其保护率不理想，因此探索新的免疫与治疗措施就显得尤为重要，我们将对此做进一步研究。

表1 HLJ-1分离菌株生化鉴定结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of HLJ-1 isolateNote:"+"for positive;"-"for negative检测项目Detection结果Results氧化酶Oxidase-触酶Catalase+脲酶Urease-吲哚Indole-硝酸还原Nitrate+葡萄糖Glucose+蔗糖Sucrose+麦芽糖Maltobiose+乳糖Lactose-木糖Xylose-甘露糖Mannose-硫化氢H2S-
图1 HLJ-1分离株16S rRNA片段的PCR扩增结果Fig.1 Amplification of 16S rRNA gene from HLJ-1 isolate by PCRM:DL2000 Marker;1:strain HLJ-
1;2:Negative control;3:Positive control
表2 HLJ-1分离菌株药物敏感性试验Table 2 Antibiotic sensitivity test of HJL-1 isolate药物名称平均抑菌圈直径/mm敏感程度DrugsDiameter of the inhibition zoneSensitivity头孢曲松Ceftriazone47High sensitivity头孢噻肟
Cefotaxime45High sensitivity头孢克肟Cefixime42High sensitivity头孢呋辛钠Cefuroxime Sodium37High sensitivity氯霉素Chloramphenicol27High sensitivity阿奇霉素Azithromycin25High sensitivity环丙沙星Ciprofloxacin22High sensitivity磷霉素Fosfomycin20High sensitivity青霉素G Penicillin G18High sensitivity庆大霉素Gentamicin16High sensitivity红霉素Erythromycin15Medium sensitivity左氧氟沙星Levofloxacin13Medium sensitivity卡那霉素Kanamycin13Medium sensitivity四环素
Tetracycline12Medium sensitivity阿莫西林Amoxicillin12Medium sensitivity 利福平Rifampin11Medium sensitivity多粘菌素B Polymixin B8Less sensitivity链霉素Streptomycin0Resistance
【相关文献】
[1]Biberstein E L,White D C.A proposal for the establishment of two newHaemophilusspecies[J].J Med Microbiol,1969,2:75-78.
[2]Olvera A,Cerda'-Cue'llar M,Mentaberre G,et al.First isolation of Haemophilus parasuisand other NAD-dependent Pasteurellaceae of swine from European wild
boars[J].Vet Microbiol,2007,125:182-186.
[3]Kielstein P,Rapp-Gabrielson V J.Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuison the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts[J].J Clin
Microbiol,1992,3(5),862-865.
[4]Oliveira S,Pijoan C.Haemophilus parasuis:new trends on diagnosis,epidemiology and control[J].Vet Microbiol,2004,(07):1-12.
[5]Oliveira S,Galina L,Pijoan C.Development of a PCR test to diagnoseHaemophilus parasuisinfections[J].J Vet Diagn Invest,2001,13(6):495-501.
[6]蔡旭旺，刘正飞，陈焕春，等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J].华中农业大学学报，2005,24(1):55-58.
[7]Zhou Xue-li,Xu Xiao-juan,Zhao Ya-xin,et al.Distribution of antimicrobial resistance among different serovars of Haemophilus parasuisisolates[J].Vet
Microbiol,2010,14(1):168-173.
[8]Martí n A J,Tuckerb A W,Navas J,et al.Antimicrobial susceptibility patterns of Haemophilus parasuisfrom pigs in the United Kingdom and Spain[J].Vet Microbiol,2001,2(3):184-191.。