CircSLC8A1＿005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用

第 45卷第1期2024 年1月
Vol.45 No.1
January 2024
中山大学学报（医学科学版）
JOURNAL OF SUN YAT⁃SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）
CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌
成纤维细胞纤维化表型的作用
胡雅婷1，6，高原2，伍华燕1，梁俣3，李晖4，徐金东5，刘宇鹏3，单志新1，6（1. 华南理工大学医学院，广东广州 510006；2. 南方医科大学第二临床医学院，广东广州 510280；3. 广东省心血
管病研究所心内科，广东广州 510080； 4. 广东省人民医院检验科，广东广州 510080； 5.广东省人民医院麻醉
科，广东广州 510080；6.广东省临床药理学重点实验室//南方医科大学附属广东省人民医院//广东省医学科学院
广东广州 510080）
摘要：【目的】　探究环形RNA circSLC8A1_005调控心肌成纤维细胞纤维化表型的作用及可能机制。

【方法】　利用腺病毒介导在小鼠心肌成纤维细胞（mCFs）中过表达circSLC8A1_005，并检测mCFs中纤维化相关因I型胶原α
1链（Col1a1）、Ⅲ型胶原α1链（Col3a1）和平滑肌肌动蛋白α2（Acta2）基因表达，通过EdU和划痕实验检测不同干预对mCFs的增殖和迁移能力的影响。

双萤光素酶报告基因实验检测circSLC8A1_005包含的潜在核糖体进入序列（IRES）的活性。

通过Western blot实验检测circSLC8A1_005翻译蛋白SLC8A1-605aa及其在细胞内分布情况。

双萤光素酶报告基因实验检测SLC8A1-605aa对超氧化物歧化酶2（Sod2）的转录激活作用。

通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA的结合作用。

放线菌素D实验检测SLC8A1-605aa对Sod2 mRNA 稳定性的影响。

【结果】　利用腺病毒可在mCFs中有效介导过表达circSLC8A1_005，过表达circSLC8A1_005可显著抑制mCFs中纤维化相关基因表达，抑制mCFs的增殖和迁移能力。

双萤光素酶报告基因实验结果提示circ⁃SLC8A1_005包含的2个IRES具有活性。

Western blot检测结果显示circSLC8A1_005可翻译预期大小为70 ku的SLC8A1-605aa蛋白，并主要分布于细胞核内。

过表达SLC8A1-605aa和circSLC8A1_005可一致地抑制mCFs的纤维化表型。

SLC8A1-605aa可特异上调超氧化物歧化酶2（Sod2）表达，但并不能转录激活Sod2表达；RIP实验结果显示SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA有特异结合作用，而放线菌素D实验结果显示SLC8A1-605aa能够增强Sod2 mRNA 的稳定性。

【结论】　CircSLC8A1_005通过翻译蛋白SLC8A1-605aa发挥抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用，SLC8A1-605aa可能是潜在的用于心肌纤维化治疗的靶点。

关键词：心肌纤维化；环形RNA；circSLC8A1_005；翻译；心肌成纤维细胞
中图分类号：R363.2 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）01-0035-10
DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.2024.0106
CircSLC8A1_005 Inhibits the Fibrotic Phenotype of Cardiac Fibroblasts by Encoding Protein HU Yating1，6， GAO Yuan2， WU Huayan1， LIANG Yu3， LI Hui4， XU Jindong5， LIU Yupeng3， SHAN Zhixin1，6
（1. School of Medicine， South China University of Technology， Guangzhou 510006， China； 2. The Second School of
Clinical Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510280， China； 3. Department of Cardiology，Guangdong
Cardiovascular Institute，Guangzhou 510080，China； 4. Department of Clinical Laboratory，Guangdong Provincial People’
s Hospital，Guangzhou 510080，China；5. Department of Anesthesiology，Guangdong Provincial People’s Hospital，
Guangzhou 510080，China；6. Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Pharmacology//Guangdong Provincial
People’s Hospital//Guangdong Academy of Medical Sciences， Southern Medical University， Guangzhou 510080， China）
Correspondence to： SHAN Zhixin； E-mail：*******************.cn
·基础研究·
收稿日期：2023-09-13 录用日期：2023-11-27
基金项目：国家自然科学基金（82070254， 82200325， 82300277）；广东省自然科学基金（2023A1515010201，2022A1515012522，2022A1515012175， 2021A1515220122）；广州市科技计划项目（202201011627，202102080093）
作者简介：胡雅婷，第一作者，研究方向：心肌纤维化的分子机制，E-mail：****************；单志新，通信作者，研究员，博士生导师，研究方向：非编码RNA与心肌重构，E-mail：*******************.cn
第45卷
中山大学学报（医学科学版）
Abstract：【Objective】To investigate the effect of circSLC8A1_005 on the fibrotic phenotype of cardiac fibroblasts and the potential mechanism involved.【Methods】 The effect of adenovirus-mediated overexpression of circSLC8A1_005 on the expression of fibrosis-related genes， collagen type I alpha 1 chain （Col1a1）， collagen type Ⅲ alpha 1 chain （Col3a1）and smooth muscle actin alpha 2 （Acta2）， in mouse cardiac fibroblasts （mCFs） were detected. The proliferation and mi⁃gration activities of mCFs were detected by EdU and wound-healing assay， respectively. Dual luciferase reporter gene as⁃say was performed to detect the activity of potential internal ribozyme entry site （IRES） in circSLC8A1_005. CircSLC8A1_ 005-translated protein， SLC8A1-605aa， and its intracellular distribution was identified by Western blot assay. The effect of SLC8A1-605aa protein on transcription activity of Sod2 gene was detected by the dual luciferase reporter gene assay. RNA binding protein immunoprecipitation （RIP） was utilized to verify the interaction between SLC8A1-605aa and super⁃oxide dismutase 2 （Sod2）mRNA. Actinomycin D treatment was used to detect the effect of SLC8A1-605aa on Sod2 mRNA stability in mCFs.【Results】 An efficient adenovirus-mediated overexpression of circSLC8A1_005 was achieved in mCFs. The enforced expression of circSLC8A1_005 suppressed proliferation and migration of mCFs， and inhibited the ex⁃pression of fibrosis-related genes in mCFs. The dual luciferase reporter gene assay revealed the activities of 2 IRES in circ⁃SLC8A1_005. Results of Western blot assay showed that circSLC8A1_005 could translate protein SLC8A1-605aa with the prospected molecular weight of 70 ku，which is predominantly distributed in the nucleus. Overexpression of the circ⁃SLC8A1_005 and SLC8A1-605aa could consistently inhibit the fibrotic phenotype of mCFs. SLC8A1-605aa could up-reg⁃ulate superoxide dismutase 2 （Sod2） expression， but not at the transcriptional level. RIP assay indicated that SLC8A1-605aa could specifically interact with Sod2 mRNA， and the results of actinomycin D assay showed that SLC8A1-605aa could enhance the stability of Sod2 mRNA in mCFs.【Conclusion】 CircSLC8A1_005 inhibits the fibrotic phenotype of cardi⁃ac fibroblasts via translating SLC8A1-605aa protein，and SLC8A1-605aa may be a potential target for the treatment of myocardial fibrosis.
Key words：cardiac fibrosis； circular RNA； circSLC8A1_005； translation； cardiac fibroblast
［J SUN Yat⁃sen Univ（Med Sci），2024，45（1）：35-44］
心肌纤维化（ myocardial fibrosis，MF）是一种几乎与所有形式的心脏疾病相关的病理变化，主要是由应激诱导的心肌成纤维细胞异常活化和向肌成纤维细胞转化引起，其特点是肌成纤维细胞中细胞外基质过度沉积和胶原蛋白的比例或成分变化，导致心脏重塑，严重将诱发心力衰竭、心肌梗死等多种心血管疾病［1-2］。

近年来研究证实，多种非编码RNA参与调节心肌纤维化的发生过程，并可能成为潜在的抑制心肌纤维化的干预靶点［3-4］。

环状
RNA（circRNAs）是一种共价闭合的单链RNA，由前体mRNA产生，具有序列组成丰富、稳定和保守的特性，并以组织、细胞类型特异性或发育阶段特异性方式表达［5］。

根据所含序列的类型，目前发现的circRNAs序列主要来自宿主基因的外显子，并主要定位于细胞质中［6］。

CircRNAs 具有不同的生物学功能，并往往与其亚细胞定位相关［7］。

CircRNAs可在转录水平调节靶基因，包括亲本基因的转录，也可以作为微小RNA（miRNA）的“分子海绵”来调控其活性，与转录调控元件结合或与蛋白互作来调控基因的转录来参与调节相关疾病进程［8］。

近期研究发现，一些circRNAs包含内核糖体结合位点（in⁃ternal ribosome entry site，IRES）以帽非依赖性方式发挥蛋白翻译功能［9-10］。

CircSLC8A1_005是由其宿主基因溶质载体家族8成员1（solute carrier fami⁃ly 8 member1，SLC8A1）的第一个外显子通过反向
剪接产生的环形RNA，全长为1832 nt。

我们前期的circRNA表达谱分析结果显示，circSLC8A1_005在心衰病人心肌标本中表达显著升高，但其对心肌纤维化的调控作用尚不清楚。

序列分析结果提示，该circRNA包含一个可能的开放阅读框（open read⁃ing frame，ORF）及两个IRES位点。

本文旨在利用乳小鼠心肌成纤维细胞（mouse cardiac fibroblasts，mCFs）来研究circSLC8A1_005对纤维化表型的调节作用，并明确其是否能够翻译蛋白，并通过翻译的蛋白来发挥对mCFs纤维化表型的调节作用。

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第1期胡雅婷，等.CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用
1 材料与方法
1.1　实验动物
出生1~3 d的SPF级C57BL/6乳小鼠（雌雄不限）均由广东省动物中心提供，生产许可证号为SCKK（粤）2013-0034，动物实验伦理审查批号为KY-N-2022-066-01。

1.2　主要试剂
胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）（Gibco）；细胞培养基DMEM/F12和澳洲胎牛血清（Bio Ind）；胶回收试剂盒、RIPA裂解液和NP40裂解液（碧云天）；质粒提取试剂盒（Omega）；BCA蛋白定量试剂盒、IP试剂盒（Thermo）；逆转录试剂盒（Takara）； Trizol裂解液、转染试剂Lipo2000（Invitrogen）；α1-Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Type Ⅰ Alpha 1，COL1A1）抗体（Invitro⁃gen）；α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（Abcam）；α1-Ⅲ型胶原蛋白（Collagen Type Ⅲ Alpha 1，COL3A1）抗体（Protein Technolo⁃gy）；ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel （Sigma）；Flag-M2抗体（Sigma）；ECL化学发光检测试剂盒（Milli⁃pore）；放线菌素D（生工有限公司）；核糖核酸外切酶（Ribonuclease R）（广州吉赛生物）；RIP试剂盒（广州伯信生物）。

1.3　主要方法
1.3.1　乳小鼠心肌成纤维细胞的分离、培养　将刚出生1~3 d的 SPF级别的 C57BL/6小鼠（雌雄不限）浸入75 %乙醇进行消毒处理，医用无菌眼科剪沿腋下剪开，镊子小心取出完整心脏，用预冷的PBS 清洗，适当修剪心脏周围多余组织，加入胰蛋白酶-PBS混合液于50 mL离心管中消化16 h，终止消化后巴氏管吹散离心，弃去上清，多次消化重悬后加入到培养瓶中培养，并传代培养至P2代用于后续实验。

1.3.2　实时荧光定量RT-qPCR检测　利用trizol 法从乳小鼠心肌成纤维细胞中提取总RNA，以1.0 μg总RNA为模板，使用ReverTra Ace qPCR RT Kit 按照说明书进行逆转录得到cDNA，合成引物用于检测circSLC8A1_005、Sod2及纤维化相关基因mRNA的表达。

使用qTOWER 3G（德国，real time system）检测系统进行定量PCR反应。

以2-ΔΔCt法计算circSLC8A1_005及其他编码基因的表达水平。

本文所用RT-qPCR特异引物序列见表1。

1.3.3　蛋白免疫印迹Western blot　PBS清洗后置
细胞板于冰上，加入适量RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂）静置10 min待其裂解充分后刮板，收集细胞悬液离心后取上清。

测定蛋白浓度后取15 μg蛋白，加入SDS-PAGE Loading Buffer，金属浴中99 ℃变性30 min。

通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜。

用5 %牛奶封闭1 h，根据目的蛋白大小裁下相应膜条，利用特异性抗体COL1A1（1：5 000）、COL3A1（1：5 000）、flag-M2（1：1 000）α
-SMA（1：2 500）和GAPDH（1：5 000），4 ℃孵育过夜，第二天37 ℃孵育二抗1.5 h，最后用ECL印迹检测试剂进行显影。

Image J 软件对目的蛋白进行灰度值分析。

1.3.4　重组腺病毒的制备　CircSLC8A1_005序列源于其宿主基因SLC8A1的第1外显子序列。

按课题组前期报道的方法，pAd-Track-cmv载体的多克隆位点中定向插入circSLC8A1_005 -2flag序列，利用腺病毒骨架质粒 pAd-Easy-I 进行重组，PacⅠ内切酶将其线性化后转入HEK293细胞中包装成重组腺病毒［11］。

根据预测circSLC8A1_005翻译蛋白SLC8A1-605aa序列，合成了其对应的编码碱基序列，并构建其重组腺病毒。

1.3.5　细胞增殖实验　将P2代mCFs均匀接种于confocal 皿中，培养24 h后在mCFs中加入适当剂量的病毒。

24 h后换含有EdU增殖试剂盒中试剂A 的培养基，孵育4 h，室温固定过夜。

完成后弃去，PBS清洗一次，甘氨酸中和后加入0.5 % Triton X-100通透，然后加入配好的Apollo染色工作液充分染色30 min，清洗后滴加4滴DAPI染液进行细胞核染色，激光共聚焦显微镜下观察拍照并进行分析。

1.3.6　细胞划痕实验　将重悬好的乳小鼠成纤维细胞接种于6孔细胞板，细胞处理后用枪头垂直进行划痕，PBS缓冲液轻柔冲洗后加入新的培养基，显微镜下分别拍照记录0和24 h的划痕距离，用Image J软件分析并且计算细胞迁移率。

1.3.7　RNA结合蛋白免疫沉淀实验　准备乳小鼠成纤维细胞铺于10 cm2皿中，稳定培养至密度80 %后，rAd-SLC8A1-605aa进行感染，培养24 h。

使用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）试剂盒去除DNA后将细胞裂解样品分为SLC8A1-605aa、IgG组，将相应的细胞裂解液与5 μg对照IgG抗体或Flag抗体（SLC8A1-605aa与Flag标签融合表达）在4 ℃旋转孵育过夜，随后加入磁珠进行免疫沉淀。

提取总
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RNA用于RT-qPCR检测目的基因的表达。

1.3.8　双萤光素酶报告基因实验　分别构建包含
circSLC8A1_005潜在IRES序列及小鼠Sod2基因启
动子区的重组萤光素酶报告基因质粒。

将
HEK293细胞接种于24孔细胞板稳定生长后，使用
Lipfectamine 2000将重组萤光素酶报告基因质粒和
pRL-TK质粒共转染细胞。

24 h后，用Dual-Lucif⁃
erase Reporter Assay Kit （Promega）测定萤光素酶活
性。

结果显示为萤火虫萤光强度与海肾萤光强度
的比值表示报告基因的相对表达水平。

1.3.9　放线菌素D实验　在乳小鼠心肌成纤维细
胞中感染适当剂量rAd-SLC8A1-605aa，稳定培养
24 h后在细胞培养基中加入2 μg/mL放线菌素D，
进行处理0、4、8、12、24 h，提取总RNA后，通过RT-
qPCR分析Sod2 mRNA的稳定性。

1.4　统计学分析
采用Image J和GraphPad Prism9.0.0分析与作
图，用SPSS 21.0进行统计分析。

实验数据用均
数±标准差表示，当两组间作比较时，采用t检验；
当多组间作比较时，采用单因素方差分析；在组间
两两作比较时，则用Bonferroni校正的t检验。

当P
＜0.05时，则为数据间的差异具有统计学意义。

2 结果
2.1　CircSLC8A1_005抑制心肌成纤维细胞的纤
维化相关基因表达
CircSLC8A1_005序列来自于宿主基因SLC8A1的第一外显子，长度为1 832碱基（图1A）。

利用制备好的circSLC8A1_005腺病毒感染mCFs 24 h，RT-qPCR结果提示该circRNA可在mCFs中有效过表达（图1B）， DNA测序结果显示过表达的circSLC8A1_005具有正确的接头序列（图1C）。

RT-qPCR结果显示，在过表达circSLC8A1_005的mCFs中，心肌纤维化相关基因Col1a1（I型胶原蛋白）、Col3a1（Ⅲ型胶原蛋白）和Acta2（肌动蛋白α 2）的表达显著下调（图1D）。

Western blot结果显示，过表达circSLC8A1_005可显著抑制mCFs 中COL1A1、COL3A1和α-SMA的表达（图1E）。

2.2　CircSLC8A1_005抑制心肌成纤维细胞的增殖和迁移
EdU实验结果显示，过表达circSLC8A1_005显
著抑制mCFs的增殖能力（图2A），而细胞划痕实验显示，过表达circSLC8A1_005可明显抑制mCFs的迁移能力（图2B），以上结果说明过表达circ⁃
SLC8A1_005可有效抑制mCFs的增殖和迁移。

2.3　CircSLC8A1_005编码蛋白SLC8A1-605aa
通过数据库circBank （http：/// searchCirc.html）进行序列分析提示，circSLC8A1_ 005包含两个潜在的IRES序列和一个开放阅读框（ORF），预测circSLC8A1_005可编码605个氨基酸的蛋白，命名为SLC8A1-605aa（图3A）。

通过双萤光素酶实验提示，与阳性对照circ_0001742相比，circSLC8A1_005所包含的两个IRES序列具有更显著的介导下游ORF翻译的作用（图3B）。

利用腺病毒介导在mCFs中过表达带有Flag标签的融合蛋白SLC8A1-605aa-flag，Western blot检测结果显示在
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第1期胡雅婷，等.CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用
mCFs 中表达出约70 ku 大小的特异蛋白（图3C ）。

进一步的核质组分蛋白检测证实，表达的SLC8A1-605aa-flag 主要分布于mCFs 细胞核中（图3D ）。

2.4　CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制mCFs
中纤维化相关基因表达和mCFs 增殖迁移能力
分别用circSLC8A1_005-flag 和SLC8A1-605aa-flag 的重组腺病毒感染mCFs ，Western blot 结果显示，过表达circSLC8A1_005和SLC8A1-605aa 可一致地抑制mCFs 中纤维化相关蛋白（COL1A1、COL3A1和α-SMA ）表达（图4A ）。

EdU 和细胞划痕
实验显示，过表达circSLC8A1_005和SLC8A1-605aa 均可有效抑制mCFs 的增殖和迁移（图4B 、4C ）。

2.5　SOD2介导SLC8A1-605aa 抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型
本文利用过表达SLC8A1-605aa 的mCFs 样本进行基因表达的RNA-seq 分析，结果显示过表达SLC8A1-605aa 可引起mCFs 中一系列相关基因的差异表达变化（图5A ）。

差异表达基因的GO 分析结果提示包括抗氧化通路在内的多个信号通路的基因表达发生明显改变（本文未示）。

RT-qPCR
验
A: CircSLC8A1_005 sequence derives from exon 1 of SLC8A1 gene. B: Over-expression of circSLC8A1_005 in mCFs detected by RT-qPCR as⁃
say; C: Sanger sequencing results showed the correct junction sequence of the exogenously overexpressed circSLC8A1_005 in mCFs. D: MRNA expres⁃sion of Col1a1, Col3a1 and Acta2 in mCFs with overexpression of circSLC8A1_005, Col1a1: t = 4.199, *P =0.017 vs . Vector ；Col3a1: t = 2.898, *P =
0.0442 vs . Vector ；Acta2: t = 5.374, **P =0.0058 vs . Vector. E: Protein expression of COL1A1, COL3A1 and α-SMA in mCFs with overexpression of circ⁃SLC8A1_005，COL1A1: t = 3.737, *P =0.0202 vs . Vector ；COL3A1: t = 4.374, *P =0.0119 vs . Vector ；α-SMA: t = 4.500, *P =0.0108 vs . Vector. Data are
shown as Mean ± SD. n =3.
图1　CircSLC8A1_005可抑制心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达
Fig. 1　CircSLC8A1_005 suppresses fibrosis-related gene expression in cardiac fibroblasts
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中山大学学报（医学科学版
）A: Proliferaion activity of mCFs by Edu assay. t = 3.811, *P =0.018 9 vs . Vector ；B: Migration activity of mCFs by wound healing assay. t = 8.751,
***P =0.000 9 vs . Vector. Data are shown as Mean ± SD. n =3.
图2　CircSLC8A1_005抑制乳小鼠心肌成纤维细胞增殖和迁移
Fig. 2　
CircSLC8A1_005 inhibits proliferation and migration of cardiac fibroblasts
A: The potential IRES and ORF sequences in circSLC8A1_005. B: The dual-luciferase reporter gene assay was performed to determine IRES activ⁃
ity of circSLC8A1_005. F =24.72, P =0.000 2, *P =0.017 3, *P =0.011 3 vs . circ_0001742-IRES ；C: Expression of SLC8A1-605aa in mCFs with over-ex⁃pression of circSLC8A1_005 by Western blot assay. D:SLC8A1-605aa cellular localization in mCFs with over-expression of circSLC8A1_005 demon⁃
strated by Western blot assay. Data are shown as Mean ± SD. n =3.
图3　CircSLC8A1_005编码蛋白的鉴定
Fig. 3　Identification of the protein translated by circSLC8A1_005
40
第1期胡雅婷，等.CircSLC8A1_005
通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用
A: Protein expression of fibrosis-related genes in mCFs with over-expression of circSLC8A1_005 and SLC8A1-605aa, respectively. COL1A1: F =
82.87, P <0.000 1, ***P =0.000 2, ***P <0.000 1 vs . Vector ；COL3A1: F =37.99, P =0.000 4, **P =0.002 4, ***P =0.000 3 vs . Vector ；α-SMA: F =14.62, P =0.004 9, **P =0.005 1, **P =0.007 3 vs . Vector. B: Proliferaion activity of mCFs by Edu assay. F =77.82, P <0.000 1, ***P =0.000 3, ***P <0.000 1 vs . Vector ；
C: Migration activity of mCFs by wound healing assay. F =39.14, P =0.000 4, **P =0.002 0, ***P =0.000 3 vs . Vector. Data are shown as Mean ± SD. n =3.
图4　CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制mCFs 的纤维化表型
Fig. 4　CircSLC8A1_005 suppresses the fibrotic phenotype of mCFs by encoding protein
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）A: mRNA profiling of mCFs with overexpression of SLC8A1-605aa. The up-regulated and down-regulated genes over 2-fold change were indicat⁃
ed. B: MRNA expression of the antioxidant-related genes detected by RT-qPCR assay, t = 3.541, **P =0.007 6 vs . Vector. C: Protein expression of fibro⁃sis-related genes in mCFs by Western blot assay. COL1A1: F =31.02, P <0.000 1, **P =0.001 5, ***P <0.000 1, ***P =0.000 2 vs . Vector ；COL3A1: F =29.63, P =0.000 1, ***P <0.000 1, ***P =0.000 2, **P =0.004 1 vs . Vector ；α-SMA: F =33.50, P <0.000 1, ***P <0.000 1, ***P <0.000 1, ***P =0.000 8 vs . Vec⁃tor ；SOD2: F =55.10, P <0.000 1, **P =0.003 8, ***P <0.000 1, ***P <0.000 1 vs . Vector. D: Identification of the effect of SLC8A1-605aa on Sod2 transcrip⁃
tion activation by the dual luciferase reporter gene assay. E: RIP and RT-qPCR assay revealed the interaction between SLC8A1-605aa and Sod2 mRNA, t = 3.738, *P =0.020 2 vs . Ig G ；F: Sod2 mRNA level was measured by RT-qPCR assay in mCFs exposed to actinomycin D treatment at different time-points. t =2.844, *P =0.046 7 vs . Vector ；t =3.450, *P =0.026 0 vs . Vector ；t =4.257, *P =0.013 1 vs . Vector ；t =3.451, *P =0.026 0 vs . Vector. Data are
shown as Mean ± SD. n =3.
图5　SOD2介导SLC8A1-605aa 发挥抑制mCFs 中纤维化相关基因表达的作用
Fig. 5　SOD2 mediates the inhibitory effect of SLC8A1-605aa on fibrosis-related genes expression in mCFs
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第1期胡雅婷，等.CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用
证结果显示，SLC8A1-605aa可上调mCFs中抗氧化相关基因表达，其中Sod2基因表达上调最显著（图
5B）。

Western blot结果显示，分别利用腺病毒介导过表达circSLC8A1_005、SLC8A1-605aa和Sod2可以一致性地抑制mCFs中纤维化相关基因表达（图5C）。

双萤光素酶报告基因实验提示过表达SLC8A1-605aa不能特异激活Sod2基因转录表达（图5D）。

RIP和RT-qPCR结果显示，SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA具有特异的结合作用（图5E）。

进一步的放线菌素D实验结果显示，mCFs中过表达SLC8A1-605aa可明显增强Sod2 mRNA的稳定性（图5F）。

3 讨论
心肌结构重塑的关键病理特征之一即心肌纤维化，其组织病理学变化的重要特点是胶原蛋白含量的增加，且比例失调，同时这也是导致许多心血管疾病的重要因素［12］。

本文首先证实过表达circ⁃SLC8A1_005可抑制mCFs中纤维化相关基因表达的作用。

鉴于心肌纤维化发生中心肌成纤维细胞的增殖和迁移能力增强［1］，本文的EdU和划痕实验结果证实过表达circSLC8A1_005可明显抑制mCFs 的增殖和迁移能力，因此，过表达circSLC8A1_005具有抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用。

CircRNAs的共价闭环结构使其具备高稳定性和独特的分子构象，参与发挥多种生物学功能［13］。

随着研究的深入，现已发现了40多种环状RNA具有翻译蛋白的作用，其中circCFLAR，circSLC8A1和circMYBPC3等是被证实可在心肌中翻译蛋白的circRNA［14- 16］。

如circNlgn是由神经球蛋白基因第二个外显子所产生的circRNA，在心脏中高度表达，能够在心脏中翻译了一种新的异构体Nlgn173，通过与Lamin B结合入核，诱导激活生长蛋白抑制剂4（ING4）和血清和糖皮质激素诱导的激酶-3（C8orf44-SGK3）启动子，从而影响心肌重塑的过程［16］。

本文通过在线数据库预测circSLC8A1_005包含潜在的 IRES 及 ORF序列，双萤光素酶报告基因实验结果显示，与阳性对照IRES（circ_0001742包含的IRES介导其翻译蛋白作用［17］）相比，circ⁃SLC8A1_005包含的2个潜在IRES 序列同样可介导下游ORF进行蛋白翻译。

通过引入Flag标签编码序列，进一步通过Western blot检测证实circ⁃
SLC8A1_005可特异翻译出605aa的SLC8A1-605aa 蛋白。

功能实验证实，过表达SLC8A1-605aa可与circSLC8A1_005一致地发挥抑制mCFs纤维化表型的作用，提示circSLC8A1_005可通过翻译SLC8A1-605aa发挥抑制心肌纤维化的作用。

鉴于SLC8A1-605aa主要定位于mCFs胞核内，本文假设其可能参与相关基因的表达调控，并发挥抑制mCFs纤维化表型的作用。

为了探究SLC8A1-605aa发挥抑制纤维化表型作用的下游靶基因，本文进行了过表达SLC8A1-605aa后mCFs的RNA-seq分析，发现并证实Sod2等抗氧化相关基因可被SLC8A1-605aa显著上调表达。

功能研究显示SOD2可与circSLC8A1_005和SLC8A1-605aa一致具有抑制mCFS中纤维化相关基因表达的作用。

SOD2是定位于线粒体基质和内膜的主要抗氧化酶，由核 DNA 编码，能够清除线粒体中发生的氧化还原和电子反应所产生的氧自由基，在调节 ROS 平衡方面发挥着极其关键的作用，而 ROS 生成增加被认为与扩张性心肌病和糖尿病诱导的心脏纤维化的严重程度和病因密切相关［18-19］。

细胞内定位分析结果显示，SLC8A1-605aa主要富集于细胞核中，但双萤光素酶报告基因实验结果显示，SLC8A1-605aa对Sod2基因没有转录激活作用，因此推测SLC8A1-605aa可能会与Sod2 前体mRNA结合来维持其稳定性，并增加Sod2 mRNA的生成和蛋白翻译过程。

进一步的RIP实验提示SLC8A1-605aa与Sod2 前体mRNA有结合作用，而放线菌素D处理实验证实SLC8A1-605aa可以显著增加Sod2 mRNA的稳定性。

因此，circSLC8A1_005翻译的SLC8A1-605aa是在转录后水平来增加Sod2 mRNA稳定性和Sod2蛋白表达，进而抑制纤维化相关基因表达的作用。

综上，本文证实circSLC8A1_005翻译的SLC8A1-605aa蛋白通过增加Sod2 mRNA稳定性和蛋白表达，发挥抑制mCFs纤维化表型的作用。

后续我们将通过整体动物水平实验，来进一步明确circSLC8A1_005发挥抑制心肌纤维化的作用机制，为以circRNA为干预靶点的心肌纤维化治疗研究提供科学资料。

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第45卷
中山大学学报（医学科学版）
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（编辑孙慧兰）
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