高效液相色谱原料及教案
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三、HPLC系统
HPLC系统一般由储液器、输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。 工作流程是：储液器中的流动相被高压泵打入系统样品溶液经进样器进入流动相，呗流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解析的分配过程，各组分在移动速度上
Inject
t
R
W
W
Time
1/2
B
理论塔板数和理论塔板高度的计算方法
理论塔板数 N = 16(tR/WB)2 = 5.54(tR/W1/2)2 理论塔板高度 HETP = L/N
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易(tR/W1/2)2
标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 峰面积(peak area，A)——峰与峰底所包围的面积。
应用最普遍的反相色谱
反相色谱：基于分子的极性分离 洗脱次序：极性高的先被洗脱 常用的流动相： 水和有机溶剂如甲醇、乙腈 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： C18、C8、苯基等基团 反相色谱固定相多为键合相
正相色谱与反相色谱的比较
二、基本概念
1．色谱图和峰参数
色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
3．柱效参数
理论塔板数(theoretical plate number，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效） N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。 N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。
正相、反相色谱法比较
极性
常用固定相
常用流动相
正相色谱
固定相>流动相
聚乙二醇、 氨基与腈基键合相
正已烷、环已烷 ，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
反相色谱
固定相<流动相
非极性固定相（如C18、C8）
水或缓冲液、甲醇、乙腈、常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间
三、HPLC系统
下面将分别叙述其各自的组成与特点：
三、HPLC系统
1．输液系统 该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的
三、HPLC系统
性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 - -输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量 和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下 性能：
按两相的物理状态可分为：液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)， 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。）
3、色谱法分类
4．相平衡参数
(1)分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比 . (2)容量因子(capacity factor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。 (3)选择性因子(selectivity factor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。
色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 峰底——基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。 峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ 半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ
3、色谱法分类
目前我们常用的就是：液液分配色谱法（正相与反相），其中反相最广泛，占整个HPLC应用的80%左右 。
液液色谱法
将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
溶解性 分子的极性对物质溶解性有很大影响。极性分子易溶于极性溶剂，非极性分子易溶于非极性溶剂，也即“相似相溶”。蔗糖、氨等极性分子和氯化钠等离子化合物易溶于水。具有长碳链的有机物，如油脂、石油的成分多不溶于水，而溶于非极性的有机溶剂。
分子极性对物理性质的影响
熔沸点 在分子量相同的情况下，极性分子比非极性分子有更高的沸点。这是因为极性分子之间的取向力比非极性分子之间的色散力大。
液相色谱理论发展简况
60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
1、色谱法的原理
1、色谱法的原理
简单的说，就是溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法分离是一个物理过程。
色谱参数
tR=保留时间 R: 分离度 t0=死时间 K´: 容量因子 W=峰底宽度
Detector Response
Time
A
B
W
W
A
B
Inject
t0
tR(A)
tR(B)
t- t
W+ W
R = 2
t- t
W+ W
= 1.176
K´=
t-t0
t0
2．定性参数（保留时间）
保留时间(retention time，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
t- t
W+ W
R = 2
t- t
W+ W
= 1.176
影响分离度(R)值的因素
Δt
W
=
R =
1/4
N
x
α- 1
x
k'
1 + k'
容量因子
选择性
柱效
α
提高分离度有三种途径
①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。 ②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。 ③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些。
5．分离参数
分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。 当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国兽药典》规定R应大于1.5。
高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography)
HPLC
目前高效液相色谱法（HPLC法)应用在药品分析中越来越多，在饲料、饲料中药物检测、畜产品残留检测方法中的应用更是广泛，高效液相色谱仪也将由原来尖端的精密仪器发展成为一个常规的分析仪器。因此每一个分析人员应该掌握并应用好HPLC。
液液色谱法的分类
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)
极性的概念
极性指一根共价键或一个共价分子中电荷分布的不均匀性。如果电荷分布得不均匀，则称该键或分子为极性；如果均匀，则称为非极性。物质的一些物理性质（如溶解性、熔沸点等）与分子的极性相关。
分子极性对物理性质的影响
三、HPLC系统
产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。 目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司、岛津公司、赛默飞世尔公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。
一、概述
液相色谱理论发展简况
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下 ，结果色素中各组分分离形成各种不同颜色的谱带。 Tswett用希腊语chroma(色）和graphos(谱）描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法）。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，
三、HPLC系统
①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要； ②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min； ③输出压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积小； ⑤密封性能好，耐腐蚀。
按分离过程的机理分 -吸附色谱 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和 力的不同表 现分离。 -分配色谱 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度（分配 系数）不同 。
3、色谱法分类
-离子交换色谱 根据样品组分离子交换亲和力的差异分离，简称离子色谱（IC)。 -体积排除色谱 ◇GPC -固定相是疏水性凝胶，流动相是有机溶剂 ◇GFC -固定相是亲水性凝胶，流动相是水溶液
-是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，分配，吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述 各作用力而达到相互分离。 -两相中有一相是固定的，叫做固定相（Stationary Phase),有一相是流动的，称为 流动相（ Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂，溶剂
2、HPLC的特点和优点
高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
3、色谱法分类
HPLC系统一般由储液器、输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。 工作流程是：储液器中的流动相被高压泵打入系统样品溶液经进样器进入流动相，呗流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解析的分配过程，各组分在移动速度上
Inject
t
R
W
W
Time
1/2
B
理论塔板数和理论塔板高度的计算方法
理论塔板数 N = 16(tR/WB)2 = 5.54(tR/W1/2)2 理论塔板高度 HETP = L/N
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易(tR/W1/2)2
标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 峰面积(peak area，A)——峰与峰底所包围的面积。
应用最普遍的反相色谱
反相色谱：基于分子的极性分离 洗脱次序：极性高的先被洗脱 常用的流动相： 水和有机溶剂如甲醇、乙腈 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： C18、C8、苯基等基团 反相色谱固定相多为键合相
正相色谱与反相色谱的比较
二、基本概念
1．色谱图和峰参数
色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
3．柱效参数
理论塔板数(theoretical plate number，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效） N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。 N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。
正相、反相色谱法比较
极性
常用固定相
常用流动相
正相色谱
固定相>流动相
聚乙二醇、 氨基与腈基键合相
正已烷、环已烷 ，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
反相色谱
固定相<流动相
非极性固定相（如C18、C8）
水或缓冲液、甲醇、乙腈、常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间
三、HPLC系统
下面将分别叙述其各自的组成与特点：
三、HPLC系统
1．输液系统 该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的
三、HPLC系统
性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 - -输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量 和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下 性能：
按两相的物理状态可分为：液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)， 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。）
3、色谱法分类
4．相平衡参数
(1)分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比 . (2)容量因子(capacity factor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。 (3)选择性因子(selectivity factor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。
色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。 峰底——基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。 峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ 半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ
3、色谱法分类
目前我们常用的就是：液液分配色谱法（正相与反相），其中反相最广泛，占整个HPLC应用的80%左右 。
液液色谱法
将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
溶解性 分子的极性对物质溶解性有很大影响。极性分子易溶于极性溶剂，非极性分子易溶于非极性溶剂，也即“相似相溶”。蔗糖、氨等极性分子和氯化钠等离子化合物易溶于水。具有长碳链的有机物，如油脂、石油的成分多不溶于水，而溶于非极性的有机溶剂。
分子极性对物理性质的影响
熔沸点 在分子量相同的情况下，极性分子比非极性分子有更高的沸点。这是因为极性分子之间的取向力比非极性分子之间的色散力大。
液相色谱理论发展简况
60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
1、色谱法的原理
1、色谱法的原理
简单的说，就是溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法分离是一个物理过程。
色谱参数
tR=保留时间 R: 分离度 t0=死时间 K´: 容量因子 W=峰底宽度
Detector Response
Time
A
B
W
W
A
B
Inject
t0
tR(A)
tR(B)
t- t
W+ W
R = 2
t- t
W+ W
= 1.176
K´=
t-t0
t0
2．定性参数（保留时间）
保留时间(retention time，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
t- t
W+ W
R = 2
t- t
W+ W
= 1.176
影响分离度(R)值的因素
Δt
W
=
R =
1/4
N
x
α- 1
x
k'
1 + k'
容量因子
选择性
柱效
α
提高分离度有三种途径
①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。 ②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。 ③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些。
5．分离参数
分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。 当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国兽药典》规定R应大于1.5。
高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography)
HPLC
目前高效液相色谱法（HPLC法)应用在药品分析中越来越多，在饲料、饲料中药物检测、畜产品残留检测方法中的应用更是广泛，高效液相色谱仪也将由原来尖端的精密仪器发展成为一个常规的分析仪器。因此每一个分析人员应该掌握并应用好HPLC。
液液色谱法的分类
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)
极性的概念
极性指一根共价键或一个共价分子中电荷分布的不均匀性。如果电荷分布得不均匀，则称该键或分子为极性；如果均匀，则称为非极性。物质的一些物理性质（如溶解性、熔沸点等）与分子的极性相关。
分子极性对物理性质的影响
三、HPLC系统
产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。 目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司、岛津公司、赛默飞世尔公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。
一、概述
液相色谱理论发展简况
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下 ，结果色素中各组分分离形成各种不同颜色的谱带。 Tswett用希腊语chroma(色）和graphos(谱）描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法）。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，
三、HPLC系统
①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要； ②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min； ③输出压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积小； ⑤密封性能好，耐腐蚀。
按分离过程的机理分 -吸附色谱 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和 力的不同表 现分离。 -分配色谱 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度（分配 系数）不同 。
3、色谱法分类
-离子交换色谱 根据样品组分离子交换亲和力的差异分离，简称离子色谱（IC)。 -体积排除色谱 ◇GPC -固定相是疏水性凝胶，流动相是有机溶剂 ◇GFC -固定相是亲水性凝胶，流动相是水溶液
-是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，分配，吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述 各作用力而达到相互分离。 -两相中有一相是固定的，叫做固定相（Stationary Phase),有一相是流动的，称为 流动相（ Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂，溶剂
2、HPLC的特点和优点
高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
3、色谱法分类