几种抗凝血药物与人血清白蛋白的相互作用

硕士学位论文
M．D．Thesis
几种抗凝血药物与人血清白蛋白的相互作用
Study on the Interaction between Several
Anticoagulants and Human Serum Albumin
张琼
Zhang qiong
西北师范大学化学化工学院
目 录
独创性声明 (i)
中 文 摘 要 (ii)
Abstract (iii)
第一章 绪 论 (1)
1.1血清白蛋白简介 (1)
1.1.1蛋白质的空间结构 (1)
1.1.2人血清白蛋白（Human serum albumin, HSA） (2)
1.1.2.1 人血清白蛋白的结构 (3)
1.1.2.2人血清白蛋白的生物学功能 (4)
1.1.2.3人血清白蛋白的光谱学特征 (4)
1.2 小分子物质与蛋白质相互作用的研究方法 (6)
1.2.1 紫外吸收光谱法（UV absorption spectroscopy） (6)
1.2.2圆二色谱法（Circular dichroism，CD） (6)
1.2.3 核磁共振波谱法（Nuclear magnetic resonance，NMR） (7)
1.2.4 红外光谱法（Infrared spectroscopy，IR） (8)
1.2.6色谱分析（Chromatography） (12)
1.3 荧光光谱法在研究小分子物质与蛋白质结合反应中的应用 (13)
1.3.1 结合部位的确定 (13)
1.3.2 结合距离的确定 (14)
1.3.3 荧光猝灭机理的确定 (15)
1.3.4 结合常数与结合位点数的测定 (16)
1.3.5 作用力类型的确定 (18)
1.3.6 小分子对血清白蛋白构象的影响 (18)
1.4 本论文研究内容及其意义 (19)
参考文献： (19)
第二章 华法灵钠与人血清白蛋白的相互作用研究 (25)
2.1 引言 (25)
2.2 实验部分 (25)
2.2.2 实验方法 (26)
2.3 结果与讨论 (26)
2.3.1 荧光光谱 (26)
2.3.2 荧光猝灭方式 (27)
2.3.3 用静态猝灭法分析华发灵钠与HSA的相互作用 (29)
2.3.4 华法灵钠与HSA之间的作用力类型 (30)
2.3.5 同步荧光光谱 (30)
2.3.6 紫外光谱 (31)
2.3.7 HSA的构象变化 (32)
2.4 结论 (33)
参考文献 (33)
第三章 华法灵过渡金属配合物与人血清白蛋白相互作用研究 (35)
3.1 前言 (35)
3.2 实验部分 (35)
3.2.1 仪器与试剂 (35)
3.2.2 实验方法 (36)
3.3 结果与讨论 (36)
3.3.1 荧光光谱 (36)
3.3.2 荧光猝灭方式 (38)
3.3.3 用静态猝灭法分析配合物与HSA的相互作用 (40)
3.3.4 二元配合物与HSA之间的作用力类型 (41)
3.3.5 同步荧光光谱 (42)
3.3.6 紫外光谱 (44)
3.4 结论 (46)
参考文献 (46)
第四章 水杨酸与人血清白蛋白的相互作用研究 (49)
4.1引言 (49)
4.2 实验部分 (49)
4.2.1 仪器与试剂 (49)
4.3 结果与讨论 (50)
4.3.1 荧光光谱 (50)
4.3.2 荧光猝灭机理、荧光猝灭速率常数 (50)
4.3.3 结合常数及结合位点数 (53)
4.3.4 热力学参数和作用力类型 (54)
4.3.5 同步荧光光谱 (54)
4.3.6 紫外光谱 (55)
4.3.7 HSA的构象变化 (56)
4.4 结论 (57)
参考文献 (57)
致 谢 (59)
西北师范大学化学化工学院专业：无机化学导师：宋玉民
中 文 摘 要
目前脑血管病已成为我国人口的第一位致残和死亡原因，且发病率有逐年增多的趋势，其中以动脉粥样硬化为基础的缺血性脑血管病发病率正在增长，故对具有抗凝血药物的研究早已是药物学家研究的重点。

而血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，它能与许多内源性和外源性物质广泛结合，药物分子进入体内后总要通过血浆的贮存和运输，到达受体部位发生药理作用，同时血清白蛋白也是血栓形成的成分之一。

因此，研究药物与血清白蛋白的作用具有重要的意义。

本论文利用荧光光谱法，紫外吸收光谱法，圆二色谱法等方法，探讨了几种具有抗凝血性能的药物与人血清白蛋白的相互作用，希望能提供一些对合成抗凝血效果好、毒性低、水溶性好的药物有参考意义。

本论文由四部分组成：
第一部分，简要介绍了人血清白蛋白的组成、结构特点、生理功能和其光谱学性质，并且对小分子物质与白蛋白相互作用的研究方法做了一些简单介绍，其中，对本文所使用的荧光光谱法进行了比较详细的介绍。

第二部分，应用荧光光谱法和圆二色谱法研究了华发灵钠与人血清白蛋白的相互作用。

观察到其对人血清白蛋白荧光产生猝灭现象，猝灭方式为静态猝灭。

计算了结合常数和结合位点数。

并且发现华发灵钠的存在明显改变人血清白蛋白的构象。

第三部分，采用光谱法研究了具抗凝血作用的过渡金属华法灵二元配合物与人血清白蛋白的相互作用，观察到铁、铜和钴二元配合物使人血清白蛋白荧光产生猝灭现象，猝灭方式为静态猝灭，并计算了配合物与人血清白蛋白的结合常数和结合位点数。

根据不同温度下的热力学函数，确定了配合物与人血清白蛋白的作用力类型。

发现配合物的存在明显改变人血清白蛋白的构象，并讨论了配合物使人血清白蛋白构象发生变化的可能原因。

第四部分，采用荧光光谱法，紫外光谱法及圆二色谱法研究了具抗凝血作用的水杨酸与人血清白蛋白的相互作用，结果表明：水杨酸对人血清白蛋白荧光产生猝灭现象，猝灭方式为静态猝灭。

通过同步荧光法和圆二色谱法发现水杨酸的存在明显改变人血清白蛋白的构象。

关键词：人血清白蛋白；华发灵钠；金属配合物；水杨酸；荧光光谱法；圆二色谱法；猝灭机理
Abstract
Nowadays cerebrovascular disease has become the first urban and rural population causes disability and death, and the incidence trend of increasing year by year. Which atherosclerosis-based incidence of ischemic cerebrovascular disease is growing, so anticoagulants for research scientists has long been a focus of the study drugs. But the serum albumin is the most abundant plasma major carrier, it works with many endogenous and exogenous substances with a wide range, the total drug molecules into the body through the storage and transport of plasma to reach the receptor site occurs pharmacological effect, while serum albumin is also a component of thrombosis. Therefore, the study drugs and the role of serum albumin has important significance. In this paper, using fluorescence spectroscopy, UV absorption s pectroscopy, Circular Dichroism(CD) method and other methods to discuss the interaction between human serum albumin(HSA) and metal complexes of anticoagulant function. Hoping to provide some of the reference for synthetic good anti-clotting effect, low toxicity, water-soluble drugs.
This paper consists of four parts:
PART Ⅰ: Introduction serum albumin’s composition, structural characteristics, physiological functions and its spectral properties briefly. Some introductions for methodology of the interaction between small molecules and HSA was discrebed. This article used fluorescence spectroscopy carried out a more detailed description.
Ⅱ Fluorescence spectroscopy, UV spectra and Circular Dichroism are PART :
applied to study interaction between human serum albumin and anticoagulants warfarin at different temperatures. The quenching mechanism of fluorescence of HSA by warfarin is found to be a static quenching procedure and the binding constant K and binding sites n are calculated. According to the thermodynamic functions at different temperatures, the binding type of warfarin to HSA is hydrongen bond and van der Waals force. The research results shown that the precense of warfarin can cause a change of the human serum albumin conformation, and the reasons for the change have been discussed.
ⅢFluorescence and UV spectra were used to study the interaction PART :
between human serum albumin and transition metals iron warfarin binary complexes with anti-cruor function. It was observed that complexes can reduce the fluorescence intensity of human serum albumin. The way of fluorescence quenching was static quenching, and then calculated the binding constant K (about 106) and binding sites n(>1). According to the thermodynamic functions at different temperatures, the binding type of complexes to HSA is hydrongen bond and van der waals. And found that complexes have obviously changed the conformation of human serum albumin. The possible reason for which the complex makes serum albumin conformation changes is discussed.At the same time, the possible reason that interaction between transition metals iron warfarin complexes and human serum albumin is stronger than transition metals iron salicylic acid complexes was further explored.
ⅣFluorescence spectroscopy, UV spectra and Circular Dichroism are PART :
applied to study interaction between human serum albumin(HSA) and Salicylate at different temperatures. The quenching mechanism of fluorescence of HSA by salicylate is found to be a static quenching procedure and the binding constant K and binding sites n are calculated. According to the thermodynamic functions at different temperatures, the binding type of Salicylate to HSA is hydrongen bond and van der Waals force. The research results shown that the precense of Salicylate can cause a change of the human serum albumin conformation, and the reasons for the change have been discussed.
Keywords: Human serum albumin; Warfarin; Salicylate; Metal complexes; Fluorescence spectrometry; Circular dichroism method; Quenching mechanism.
第一章 绪 论
1.1蛋白质简介
蛋白质是由20种天然氨基酸以肽链的形式构成的生物大分子，它承担着整个生命活动的基础，在生命活动中担负着支撑、运输、催化、调节、转运等多种功能。

蛋白质是一类重要的生物大分子，主要含有碳、氢、氧、氮、磷以及少量的硫，一些蛋白质中还会含有铜、铁、碘、锌、镁、钼等元素[1]。

1.1.1蛋白质的空间结构
蛋白质分子是由氨基酸首尾相连而形成的共价多肽链，每一种蛋白质在空间中都存在各自的天然构象。

自然界中的蛋白质有纤维蛋白和球蛋白，纤维状蛋白是杆状或者棒状的，球状蛋白则是经过多肽链盘绕卷曲形成的紧密结构。

蛋白质的分子结构主要包含以下几个层次：一次结构→二级结构→超二级结构（模体）→结构域→三级结构→四级结构。

（1）一级结构
蛋白质的一级结构是指在组成蛋白质的氨基酸肽链中的排列顺序，是构成蛋白质的最基本的结构。

在生物体中，一条由多肽组成的蛋白质一旦被合成后，即可以根据一级结构自然的折叠和弯曲，形成一定的空间构象，这是组成蛋白质空间结构的基本元件，这同时也决定了蛋白质的功能。

（2）二级结构
蛋白质特有的二级结构是指连续的肽单位借助于氢键，排列成具有周期性结构的构象。

二级结构是指蛋白质肽链局部区域的规则结构，它不涉及侧链的构象和多肽链其他部分的关系[2]。

二级结构的类型有α-螺旋、β-折叠、回折和无规则卷曲。

α-螺旋包括右手α-螺旋、左手α-螺旋、310螺旋等多种，其中最为常见的是右手α-螺旋，每圈螺旋有3.6个氨基酸残基组成，一圈螺旋的螺距为0.54 nm，每个氨基酸沿螺旋轴的长度为0.15 nm。

β-折叠是由多肽形成的一种较伸展的构象，但是并不是完全伸展。

在这种
折叠结构中，主链呈现出周期性折叠现象，同时与一些α-螺旋共同形成了蛋白质的超二级结构。

回折即多肽链中的180度转弯结构，这种结构在球蛋白中非常常见，大多数位于蛋白质分子表面。

在多肽主链中，相邻残基二面角值重复出现的构象。

α-螺旋和β-折叠这2种规则的二级结构单元在蛋白质三维结构中有重要的作用。

（3）三级结构
具有规则的二级结构的多肽链条更进一步的折叠后形成紧密的球状分子，这就是蛋白质分子的三级结构，也包括蛋白质分子中肽链一级结构中相距较远的肽键之间的几何关系和侧链三维结构中的几何关系。

蛋白质三级结构中的稳定主要靠次级键，包括氢键、盐键、疏水键和范德华力等，这些次级键可以存在于蛋白质分子一级结构中较远的氨基酸残基之间，也可以说蛋白质分子三级结构主要是氨基残基侧链的结合。

同时，次级键从本质上来说是化学中的共价键，容易受到环境中诸如pH、温度、离子强度等因素的影响，有较强的可变性。

虽然二硫键不属于次级键，但在某些肽链中可以使较远的两个肽段结合形成肽键，这对蛋白质分子的稳定有着极其重要的作用。

（4）四级结构
由两条或两条以上的具有独立三级结构的多肽链组成的蛋白质称为寡聚蛋白，分子中多肽链间通过各种次级键相互组合而成的空间结构就是四级结构，其中每个具有独立三级结构的多肽链称之为亚基，四级结构实际上就是描述亚基的立方体排布、相互作用以及接触部位的布局。

亚基之间不含有共价键，亚基间的次级键的结合要比二级、三级结构疏松，因此在一定的条件下，四级结构的蛋白质可以将其组分进行分解，得出不同的亚基，而亚基本身的构象也可以改变。

蛋白质亚基间紧密接触的界面存在着疏水相互作用和极性相互作用，而其中的主要驱动力是疏水相互作用，亚基结合上的专一性主要是由极性基团间的氢键和离子键提供的[3]。

1.1.2人血清白蛋白（Human serum albumin, HSA）
血清白蛋白是脊椎动物体血浆中含量最多的有机大分子物质，占到血浆含量的60%以上，平均浓度为0.63 mmol·L-1，约42 g·L-1。

在生物体中可以载运、结合和运输各种小分子包括：金属离子、药物分子、脂肪酸、激素等多种内源和外源分子，在生物体中发挥着非常重要的作用[4]。

人血清白蛋白在人的血浆
中同样含量非常丰富，它可以与一系列具有低分子量的物质结合[5]以降低其血中浓度，从而起到一定的缓冲作用；或者担负起运输的作用，将机体中需要和不需要的物质运送到需要的器官或者排泄器官[6]。

因为血清白蛋白的这些功能，使得人们逐渐关注这个特殊的分子，而本文通过研究其基本结构、功能以及光谱特性，探究其与金属配合物的相互作用后的荧光光谱。

1.1.
2.1 人血清白蛋白的结构
人血清白蛋白是由585个氨基酸分子构成的空间几何形状为心形的分子，它是非糖基化的单链分子，相对分子质量为67000，其中约67%的区域为α-螺旋，不包含β-折叠[7]。

通过对人血清白蛋白的组成进行分析：其含有35个半胱氨酸，具有17对链内的二硫键和一个分子表面的游离的半胱氨酸，其中有8对二硫键是相互交叉的，在接近N端的位置为一个单个二硫键，二硫键可以有效地维系着蛋白质稳定的结构。

同时，HSA中包含着18个酪氨基酸残基(Tyr)，在214位置上有1个色氨基酸残基(Trp)，N端为门冬氨基酸残基(Asp)，C端为亮氨基酸残基（Leu）[8]。

图1-1 HSA的立体结构
Fig.1-1 Solid structur of HSA
对于人血清白蛋白的三维结构：它有3个类似的结构域[9]。

如图1-1所示，这三个结构分别为Sit eⅠ、Sit eⅡ、Sit eⅢ，这三个结构域中包含着2个亚结构域，以槽口相对的方式形成圆筒状结构[9]。

1.1.
2.2人血清白蛋白的生物学功能
（1）运输功能
人体所需要的很多物质需通过血液运输，如：生物体所需要的氧、蛋白质、脂肪、微量元素、糖类、维生素和电解质等，这些物质在血液中与血清白蛋白结合后，在血液中被运输到目的地。

同时，白蛋白与脂肪酸进行有效的可逆性的结合，使其变成水溶性物质，可以吸收一些如激素等小分子物质，从而防止体内物质的流失，维持身体中物质的浓度稳定。

（2）维持机体的内环境稳定
机体细胞利用组织液与生物体的各个器官间传递水、ATP、物质等，并通过内脏器官的活动维持着体内环境的稳定，包括渗透压的稳定和酸碱平衡等。

正常人身体中的渗透压为5330毫米汞柱，质量较大的血清白蛋白分子产生较小的渗透压，仅为25毫米汞柱，这在医学中称为血清胶体渗透压，它维持着血管内的渗透压平衡。

血清中的白蛋白与其对应的钠盐缓冲对决定了血清中的pH 值，可见血清白蛋白及其无机盐缓冲对协同缓冲了血清中的酸碱变化[10]。

当血液中的pH值不相同时，血清白蛋白存在同分异构体[11,12]。

当pH值为4.5-5.7之间时为N型，pH值在3.0-4.5之间时转化为部分酸膨胀的F构象，当pH >8时为弱碱环境下的另一种膨胀B构象，3种构象可以发生相互转换[13]。

1.1.
2.3人血清白蛋白的光谱学特征
蛋白质的空间构象确定了其内源荧光生色团（主要是色氨酸）的局部微环境[14]，人血清白蛋白含有单个色氨酸残基和多个酪氨酸残基，Teale和Weber[15]等人在研究模型化合物时曾指出，当激发波长为295nm时可以排除酪氨酸的荧光。

（1）荧光光谱
人血清白蛋白分子中的色氨酸(Trp)、苯氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)残基可以在吸收紫外光的情况下，自发向外辐射荧光，所以血清白蛋白分子具有天然荧光性质。

图1-2 HSA 的荧光光谱
Fig.1-2 Fluorescence of HSA
由于该三种氨基酸残基中的R基各不相同，导致了吸收峰的位置不同；由于三种氨基酸残基在空间的位置不同，导致荧光的吸收强度不同，如图1-2所示。

按照波长排列，苯氨酸、酪氨酸和色氨酸残基分别对应的荧光波长为：282 nm，303 nm，348 nm；按照荧光强度由弱到强排列，分别为苯氨酸、酪氨酸和色氨酸，由此可见，人血清白蛋白中发光的主要基团为色氨酸残基和酪氨酸残基。

我们可以通过荧光光谱分析血清白蛋白在结合小分子配合物后其荧光光谱的变化，从而分析蛋白质结构的变化[16]。

（2）圆二色谱
血清白蛋白的圆二色谱可以分为远紫外区和近紫外区。

远紫外区波长范围是285 nm—245 nm，这个范围是肽键的吸收范围，从而可以推断蛋白质分子主链的构成状况。

在远紫外区，一般天然蛋白质分子在190 nm处有1个正的吸收峰，在204 nm—235 nm处会出现一个负槽，这个负槽可以说明蛋白质分子主链的构成状况。

研究人血清白蛋白分子的主链构成需要用圆二色谱，前面提到，人血清蛋白质分子中含有α—螺旋和无规则卷曲，而α—螺旋在209 nm和222 nm处有2个负槽，可以用来判断人血清白蛋白分子的二级结构。

近紫外区的波长范围是245 nm—320 nm，近紫外区的吸收峰与主链和侧链生色基团有关，二硫键在250 nm—260 nm处有一个吸收峰，色氨酸残基、酪氨酸残基和苯氨酸残基的三个侧链峰在230 nm—310 nm之间。

1.2 小分子物质与蛋白质相互作用的研究方法
1.2.1 紫外吸收光谱法（UV absorption spectroscopy）
紫外可见吸收是一种研究小分子配合物与血清蛋白相互作用最方便、最常用的技术[17]。

一般而言，蛋白质组成中常见的20种α-氨基酸，只有芳香族氨基酸如苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和含硫氨基酸在190—310 nm 波长范围内有吸收，这是由于该氨基酸的侧链基团(Phe的苯基、Tyr的酚基、Trp的吲哚基)中的n-π*对光有吸收作用[18]。

血清白蛋白在280 nm处的特征吸收主要是酪氨酸残基、色氨酸残基中共轭双键π-π*的吸收峰，配合物与血清白蛋白的相互作用会引起吸收带的红移(蓝移)现象或增色(减色)效应，改变了蛋白质在280 nm处的吸收，根据峰形和峰位的变化即可判定配合物是否与蛋白质发生作用。

屈凌波[19]研究组利用UV-Vis观察大黄酚与牛血清白蛋白相互作用时得出的实验结果，以及李来生[20]研究组利用UV-Vis得出的除草醚与牛血清白蛋白的相互作用结果便是成功的研究事例。

1.2.2圆二色谱法（Circular Dichroism，CD）
多数生物分子具有不对称性，有的是构型不对称型如L -和D -氨基酸，有的是构象不对称性如左手和右手蛋白质螺旋，左手和右手多糖螺旋等。

手性物质与左、右圆偏振光（E L，E R）的相互作用是不相同的[17]，例如左手螺旋与E L有更强的相互作用，因而对E L和E R的吸收也不同。

由于手性物质对E L和E R这两种光的吸收（振幅减小）不同，便使左、右圆偏振光叠合成椭圆偏振光，这种光学效应称为圆二色性[21]。

若用εL和εR分别表示手性物质对E L和E R光吸收的摩尔吸收系数，则∆ε= εR - εL为圆二色性。

圆二色性也用摩尔椭圆率[Ө]表示，∆ε与[Ө]的关系是：
[Ө] = Ө ·100·c-1·l-1 = 3300∆ε
式中椭圆率Ө= arctan(短轴/长轴) ≈ tan Ө≈ 33c·l·∆ε(对于小的Ө而言)，c =摩尔浓度、l=光程厚度(cm)。

[Ө]的单位为度·厘米2/分摩尔。

其中，∆ε的值可以是正值也可是负值。

蛋白质在远紫外区（185—245 nm）和近紫外区（245—320 nm）都可能出
峰。

远紫外区主要是肽键的吸收峰范围，表征蛋白质的主链构象，而近紫外区峰的归属却难以分析。

对于典型的α-螺旋结构在靠近192 nm有一正的谱带，在222 nm和208 nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；β-折叠在216 nm有一负峰，在185—200 nm有一正峰；β-转角在206 nm附近有一正峰。

因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出小分子金属配合物—蛋白质或多肽链相互作用时其二级结构含量改变的信息[22]。

Marco，et al. 通过圆二色谱法对几种药物对白蛋白的立体选择性进行了研究[23]，Miles，et al. 使用同步辐射圆二色法研究了蛋白质样品的变性情况[24]。

圆二色谱法是测定生物大分子构象及其变化较为有效的方法，该方法已成为研究分子构型及分子间相互作用的重要光谱手段之一。

图1-4给出了α-螺旋、β-折叠和无规卷曲的CD曲线。

图1-3 多聚L - Lys的CD光谱。

1，2，3分别是100％α-螺旋，100％β-折叠，100
％无规卷曲的CD光谱
Fig.1-3 The CD spctra of poly –L - lysine．1.100％α-helix；2.100％β-turn 3.The
random coil
1.2.3 核磁共振波谱法（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）
NMR能够测定生物大分子的三维空问结构，能够在接近生物大分子的生理环境(温度、盐浓度、pH值等)下对其溶液进行动力学行为测定，而杂核多维NMR 方法提供的结构信息量最大，复杂程度也最高[25]。

NMR能够得到的结构信息包括：小分子配合物—血清白蛋白复合物的构象、小分子与生物大子发生反应的配体的质子化状态以及配体的结合位点数和结合位置等。

NMR测定蛋白质结
构的方法包括四大基本要素：结构测定的主要NMR参数NOE(nuclear over hausereffect)距离测定；核磁谱峰序列专一性归属；NMR结构计算及结构评价；数据收集的多维NMR技术[26]。

蓝文贤等研究了扩散加权的NMR在区分正常人和冠心病患者的血清中的应用[27]，实验结果表明了扩散加权的NMR与主成分分析(PCA)相结合是将冠心病血清从正常血清中识别出来的有效方法，当b为0.85×107 s·cm-2时的区分效果最好，分子自扩散运动加权的NMR能够有效抑制小分子代谢物的共振信号强度，从而使血脂和血蛋白的NMR特征更为明显。

高愈希等[28]讨论了各种先进核分析技术在金属蛋白质组学研究中有着广泛的用途，详尽说明了金属蛋白质组学旨在研究生物体系内金属蛋白质的分布、组成、结构、特征、功能、金属结合环境及其在疾病诊断和药物开发中的应用。

Gabriella et al应用1H-NMR 研究了血红素与人血清白蛋白相互作用，结果表明血红素使得人血清白蛋白的圆二色性增强[29]。

Mathilde H. et al应用13C DNP-NMR探讨了分子之间的作用类型[30].。

以上应用都是表明了核磁共振在分析大分子物质中的独特地位。

1.2.4 红外光谱法（Infrared spectroscopy，IR）
红外光谱可以用于多肽和蛋白质分子的二级结构的研究，提供出分子间相互作用的信息，为此在小分子配合物与生物大分子相互作用检测中较为常见，但是由于水峰的存在，限制了其在水溶性生物大分子中的应用。

红外光谱法应用于蛋白质结构分析，经历了定性阶段，半定量阶段到定量阶段的发展过程。

蛋白质骨架肽链羰基伸缩振动产生红外光谱中的酰胺I谱带（1700—1620 cm-1），较公认的对酰胺I带中各子峰的指认是：波数在1650—l658 cm-1处峰面积百分含量代表α-螺旋的含量，而1620—1640cm-1处是β结构的含量[31]。

当药物分子与蛋白质分子接触时，如果α-螺旋和β-折叠在上述两个波数范围内质量数发生了变化，即一种面积减少，另一种面积增加，则说明药物分子与蛋白质分子之间发生了相互作用。

唐江红等研究了槐黄苷和人血清白蛋白的相互作用[32]，结果表明：两者之间为静态猝灭机制。

张丽等研究了Hg2＋在生物体内与牛血清白蛋白相互作用的毒性机理以及蛋白质的微观结构变化[33]，并测定了Hg2＋与牛血清白蛋白（BSA）复合体系的红外光谱（FT-IR），红外光谱实验数据表明Hg2＋与BSA发生作用的结合位点可能包括-SH、-OH和 -NH基团，采用红外拟合技术对BSA二级结
构的变化进行了研究，结果表明蛋白质α-螺旋结构含量降低，β-折叠结构含量升高。

马萍等采用傅里叶红外光谱法（FTIR ）研究了模拟生理条件下人血清白蛋白（HSA ）与骨螺紫（Mx ）及其铜配合物（Mx-Cu 2+）的相互作用[34]，实验结果表明2个体系中HSA 二级结构变化情况基本一致，α-螺旋结构明显减少约8 %，β-折叠也减少约1 %，而β-转角和无规卷曲分别增加了约6 %和4 %。

1.2.5电化学分析法（Electrochemical analysis ）
电化学分析是根据溶液中所含物质的电化学性质及其变化来确定其物质组成与浓度的方法[35]，在化学化工仪器分析中是重要的组成部分。

电化学分析过程主要针对溶液中的电导、电位、电流、电量等信号进行测量，没有分析信号的相互转换，因此与光谱分析相比仪器简单化、小型化，易于自动化和连续化分析。

蛋白质分子是生物有机大分子物质，在溶液中的导电能力各有不同，但总体较弱。

因此，在蛋白质分子的电化学分析过程中，一般采用金属离子与蛋白质分子结合，通过分析金属离子在与蛋白质分子结合前后的电学参数的变化来进行研究。

电化学分析方法主要有以下几种：电导分析法、电位分析法、电解分析法、库仑分析法、伏安法和极谱分析法。

1.2.5.1电导分析法（Conductivity analysis ）
电导分析法是通过测量溶液电导变化，来确定溶液成分含量的分析方法。

直接根据电导与溶液中待测离子浓度之间的关系进行分析的方法称为电导法；利用电导变化作为指示反应终点的容量分析技术称为电导滴定分析法。

电导法是利用电导与电解质浓度的关系式进行鉴定的方法，其表达式如下：
A l C
G 11000⋅=λ （1） i i C G λθ
⋅Σ⋅=110001 （2） 其中，G 为电导；C 为电解质溶液的浓度；l 为导体电阻长度；A 为其截面积；λ摩尔电导率；θ为电导池常数。

电导法主要用于水的纯度的鉴定和某些生产流程的控制和自动分析。

电导滴定法是以溶液的电导变化作为滴定终点的“指示剂”。

像生成的水、难电离的。