高浓度的糖刺激人肾小球内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白21的影响

・论著・文章编号:1007-8738(2004)04-0450-04
高浓度的糖刺激人肾小球内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白21的影响
丁涵露1,张建国1,朱妙珍1,罗向东2,梁光萍2
(第三军医大学:1大坪医院野战外科研究所肾内科,重庆400042;2西南医院烧伤研究所,重庆400038)
收稿日期:2003-07-06;　修回日期:2003-09-26
作者简介:丁涵露(1970-),女,山东日照人,主治医师,硕士.
T el :(023)68774819;Email :dhanlu @ey
Expression of monocyte chemoattractant protein 21in glomerular endothelial cells stimulated by high concentration of glu 2cose
DING Han 2lu 1
,
ZH ANG Jian 2guo 1
,
ZHU Miao 2zhen 1
,
LUO Xiang 2dong 2
,LIANG Guang 2ping
2
1
Department
of Nephrology ,Daping
H ospital ,
Chongqing
400042;2
Institute of Burn ,S outhwest H ospital ,Third Militory Medical University ,Chongqing 400038,China
Abstract
AIM :T o study the expre ssion of monocyte chemoattractant pro 2tein 21(MCP 21)in cultured human glomerular endothelial cells (HU GECs )stimulated by high concentration of gluco se.METH 2ODS :The effect of high concentration of gluco se on the expre s 2sion of MCP 21mRNA by HU GECs wa s detected by in situ hy 2bridization and cell E LISA.The monocyte migration induced by the conditioned media of cultured HU GECs wa s a ssayed by a modified Boyden
Chamber
micropore filtration
membrane
method.E ffects of anti 2MCP 21antibody on monocyte migration wa s detected a s well.RESU LTS :The MCP 21mRNA wa s only weakly expre ssed in HU GECs cultured under the condition of low concentration of gluco se.Following a stimulation of high concen 2tration of gluco se (25mmol/L ),MCP 21mRNA expre ssion wa s upregulated from the 8th hour and reached the maximum at the 16th hour.Conditioned medium of cultured HU GECs stimulated with high concentration of gluco se had marked chemotaxis for monocyte s ,which wa s inhibited by anti 2MCP 21antibody.CON 2C L USION:HU GEC stimulated by high gluco se may highly ex 2pre ss MCP 21,and produce chemotatic factors for monocyte s.K eyw ords :glomerular endothelial cell ;monocyte ;monocyte
chemoattractant protein 21
摘要
目的:探讨高浓度的糖对培养的人肾小球内皮细胞(H UGEC )表达单核细胞趋化蛋白21(MCP 21)的影响,以及H UGEC 的条件培养基对单核细胞(MC )的趋化作用及抗MCP 21抗体对MC 迁移的影响。

方法:采用原位杂交技术和细胞E LIS A 法,观察
MCP 21的表达;用改良的Boyden 小室微孔滤膜法,测定高浓
度的糖刺激H UGEC 后的条件培养基,对MC 的趋化作用,以及抗MCP 21抗体对MC 迁移的影响。

结果:(1)在低浓度的糖
(含5.5mm ol/L D 2葡萄糖)条件下培养的H UGEC MCP 21mRNA
呈弱表达。

高浓度的糖(含25mm ol/L D 2葡萄糖)刺激后,8h 即出现MCP 21表达增强,于16h 达高峰。

(2)高浓度的糖刺激
H UGEC 后的条件培养基,对MC 具有明显的趋化作用;抗MCP 21抗体可抑制其作用。

结论:在高浓度的糖诱导下,人H UGEC MCP 21的表达增强,其条件培养基对M C 具有趋化作用,
从而可能招引单核细胞迁入内皮下间隙。

关键词:肾小球内皮细胞;单核细胞;单核细胞趋化蛋白21中图分类号:R692.6 文献标识码:A
在糖尿病肾病的发生发展过程中,外周血单核细胞(m onocyte ,MC )浸润于肾小球间质具有极为重要的意义,但其浸润机制尚不太明确。

单核细胞趋化蛋白21(MCP 21)是新近被确认的对单核/巨噬细胞具有趋化、激活双重作用的趋化因子1。

肾小球内皮细胞(H UGEC )直接接触毛细血管中的血液,是MC 穿越的第一道屏障。

在高浓度的糖作用下,H UGEC 能否表达MCP 21?其条件培养基对MC 是否具有趋化作用?尚未见报道。

为此,我们采用原位杂交、细胞E LIS A 法,观察了高浓度的糖对H UGEC 表达MCP 21mRNA 及其蛋白的影响。

用改良的Boyden 小室微孔
滤膜法,观察了H UGEC 的条件培养基,对MC 的趋化作用及抗MCP 21抗体对MC 迁移的影响,以了解MCP 21在肾小球肾炎发生中的作用。

1　材料和方法
1.1　材料　II 型胶原酶、内皮细胞生长因子、硝酸
纤维素微孔滤膜、转铁蛋白及硒购于Sigma 公司。

培养用M199粉购于G ibco 公司。

兔抗人Ⅷ因子抗体和
小鼠抗人C D68单克隆抗体(mAb)购于北京中山公司。

SP和DAB试剂盒购于福州迈新公司。

地高辛标记、检测药盒和地高辛抗体购于宝灵曼公司。

小鼠抗人MCP21mAb购于Pharmigen公司。

人MCP21购于Promega公司。

人单核细胞白血病细胞株THP21购于上海细胞生物所。

Boyden小室由江西医学院微生物学教研室惠赠。

1.2　方法
1.2.1　H UGEC的培养与鉴定　按参考文献2的方法,用无菌Hank’s液冲净肾表面的血迹,剥离肾包膜,剪下肾皮质置于100目筛上研磨后,通过150目筛网,最后在200目筛网上收集肾小球,镜下观察其纯度达99%。

以900r/min离心10min,沉淀即为肾小球。

将其加入0.2g/L II型胶原酶(Hank’s液配制)中,于37℃振荡孵育1h,吹散细胞团,以含200m L/L FCS的M199培养液混匀后离心10min,将沉淀的细胞团吹散,置于无菌塑料培养瓶内,加入内皮细胞培养液(含200m L/L胎牛血清的M199培养液、肝素5×103U/L、内皮细胞生长因子2g/L、胰岛素、转铁蛋白及硒各5mg/L)培养4h。

洗去未贴壁的细胞,贴壁的大部分细胞即为H UGEC。

然后根据H UGEC的生长形态,以机械划除法进行纯化3。

培养的H UGEC用兔抗人Ⅷ因子抗体染色后,选择染色呈阳性的细胞进行扩大培养。

待培养瓶内稳定培养的第2代细胞基本融合后,以2.5g/L胰蛋白酶-0.2 g/L乙二胺四乙酸(E DT A)消化细胞,并以含低浓度糖的M199培养液培养传代细胞。

1.2.2　内皮细胞MCP21表达的原位杂交检测　①原位杂交探针的制作:杂交用探针为由35对碱基组成的寡核苷酸4,与MCP21cDNA的第257～291个核苷酸相互补。

探针的序列为:3′2CGG AT2 G TTGGG TTTG CTTG TCC AGG TGG TCC AAGG25′,由上海细胞生物所合成。

采用寡核苷酸3′端地高辛标记和检测药盒,按照药盒中的说明书进行标记与检测。

②原位杂交流程:将第3代生长良好的H UGEC,接种于预先放置有盖玻片的24孔细胞培养板中, 100μL/孔。

24h后,换无血清培养液,使细胞同步24 h。

实验组为含高浓度糖(25mm ol/L的D2葡萄糖)的无血清M199培养液;正常对照组为含低浓度糖(5.5 mm ol/L的D2葡萄糖)的无血清M199培养液,分别孵育8h。

弃去培养液,取出盖玻片,加40g/L多聚甲醛室温固定20min。

依次滴加蛋白酶K于37℃消化20min、再用2.5m L/L乙酸于4℃处理30min,置37℃预杂交45min。

然后,浓度为2.5mg/L的地高辛标记的MCP21寡核苷酸探针于42℃杂交16h,以4×SSC及2×SSC洗片后,加20mg/L RNA酶消化。

先后以1×SSC及0.5×SSC洗片后,加30g/L BS A于37℃封闭30min,加羊抗人地高辛抗体2碱性磷酸酶结合物(1∶
2000稀释),室温孵育1h,加氯化硝基四氮唑蓝(NBT)0.4g/L/52溴242氯232吲哚2膦酸盐(BCIP)0.2g/L,在暗盒内显色5h后终止。

实验中以不加探针的杂交液杂交的标本作为阴性对照。

1.2.3　内皮细胞MCP21表达的细胞E LIS A法检测　将H UGEC(1×109/L)培养于25cm2培养瓶中,24h 后换无血清培养液,使细胞同步24h。

然后以2.5g/ L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸(E DT A)消化细胞,按2×108个/L细胞接种于96孔板中(200μL/孔)。

待细胞完全融合后,弃上清,加含高浓度糖的无血清M199分别作用8、16、24h,于37℃、50m L/L C O2培养箱内培养。

然后用细胞E LAS A进行测定,即依次加入下列试剂:0.25g/L戊二醛固定、30m L/ L过氧化氢、0.3m L/L Tritonx2100、30g/L小牛血清白蛋白、小鼠抗人MCP21单抗(1∶500,4℃过夜)及HRP标记的链霉卵白素(1∶3000,37℃1h),每孔加入液体量为100μL。

每次加液前,用0.01m ol/L P BS漂洗3次,每次5min,用磷酸枸橼酸钠缓冲液、0.04 g/L邻苯二胺(OPD)和0.15g/L H2O2显色(37℃、5 min),以2m ol/L硫酸终止反应,在酶标仪上读取492 nm处的吸光度(A)值。

用P BS代替一抗孵育细胞,测定背景染色,用实验组的A值减去背景的A值,表示
H UGEC MCP21的表达。

实验重复3次。

1.2.4　H UGEC条件培养基对MC的趋化作用　①条件培养基的制备:将H UGEC(1×109/L)培养于25 cm2培养瓶中,24h后换无血清培养液,使细胞同步24h。

然后换含高浓度糖(浓度同上述)的无血清培养液培养16h,收集上清即为条件培养基。

非条件培养基制备基本同上,只是加含低浓度糖(浓度同上述)的无血清培养液。

②MC迁移试验:用改良的Boyden 小室进行。

下室加满各种实验液,上室加入MC (THP21)悬液(细胞密度为1×1012/L),上下室之间隔以硝酸纤维素微孔滤膜(孔径8μm,直径13mm,厚度220μm)。

将小室置于37℃、50m L/L C O2培养箱中孵育90min。

取出滤膜,经甲醇固定、苏木精染色及脱水透明后,于400×显微镜下,转动微调旋钮至焦点对准滤膜表面作为起点,可见膜结构和大量的MC,再向下转动微调旋钮,可见细胞的数目逐渐减
少,至只有2～3个细胞为止,即为MC 移动的终点。

从微调平轮的刻度上,读出起点到终点的μm 数,即为MC 移动的距离。

每膜随机取5个视野,每组两级膜共10个视野,实验共进行3次,算出平均数和标准差。

将实验分为4组:(1)随机移动组(即阴性对照组):上下室均为非条件培养基,用以观察MC 的随机移动;(2)化学促动组:上下室均为条件培养基,以观察在上下室无趋化因子的浓度梯度时MC 的移动;(3)趋化运动基组:上室为非条件培养基,下室加入H UGEC 条件培养基,以观察其对MC 是否具有趋化活性;(4)阳性对照组:上室为非条件培养基,下室加含10μg/L 人MCP 21的无血清培养液。

1.2.5　抗MCP 21抗体对MC 迁移的影响　在H UGEC
的条件培养基中,加入抗MCP 21抗体,37℃温育2h ,然后以5500r/min 离心1min ,以除去免疫复合物。

同时,用MCP 21标准品代替条件培养基作阳性对照。

实验共分6组:(1)非条件培养基组;(2)非条件培养基加抗体组;(3)条件培养基组;(4)条件培养基加抗体组;(5)阳性对照组;(6)阳性对照加抗体组。

以上结果均以x ±s 表示,采用t 检验及方差分析对数据进行统计,以P <0.01代表有显著性差异。

2　结果
2.1　HUGEC 的Ⅷ因子染色　90%的细胞为内皮细
胞,可见细胞多呈卵圆形、圆形或小棱形;阴性对照
组中的H UGEC 无Ⅷ因子的表达(图1)。

图1　H UGEC 中Ⅷ因子的表达
Fig 1　The expression of Ⅷfactor in H UGECs (SP ,×400)
A :H UGECs stimulated with anti 2Ⅷfactor antibody ;
B :H UGECs stimulated without anti 2Ⅷfactor antibody.
2.2　MCP 21表达的原位杂交检测　正常H UGEC 有
较弱MCP 21mRNA 的表达(图2A ),用含高浓度糖的条件培养基作用8h ,MCP 21mRNA 的表达增强,胞质中可见蓝紫色颗粒(图2B )。

图2　经高浓度的糖刺激后H UGEC 中MCP 21mRNA 的表达
Fig 2　The expression of MCP 21mRNA in H UGEC stimulated by high
concentration of glucose (ISH ,×200)
A :N ormal H UGECs ;
B :H UGE
C stimulated with high concentration of glu 2cose.
2.3　MCP 21表达的细胞E LISA 检测　H UGEC 经高
浓度的糖刺激后,0、8、16及24h ,用细胞E LAS A 检测MCP 21表达的A 值,分别为0.10±0.01、0.25±0.01、0.35±0.02和0.30±0.02。

从刺激后8h 开始,MCP 21的表达即有显著增强(为对照组的2.5倍),16h 达高峰(为对照组的3.5倍),24h 仍维持在较高水
平,与对照组相比较,P 值均<0.01。

2.4　HUGEC 的条件培养基对MC 迁移的影响　各
组MC 的平均移动距离见表1。

结果表明,趋化运动组和阳性对照组MC 的移动距离,明显大于随机对照
组和化学促动组(P <0.01)。

随机移动组与化学促动组相比较,差异不显著(P >0.05)。

表1　H UGEC 的条件培养基对MC 迁移的影响
T ab 1　The effect of conditional medium for H UGECs on MC
migration
(n =30,x ±s )
G roup M igratory distance (μm )
　Random migration 28.2±1.6　Chemical kinetogenesis 31.6±1.18a Chem okinesis 57.5±1.5b P ositive control
73.2±1.9
a
P >0.05,b P <0.01vs random migration group.
2.5　抗MCP 21抗体对MC 迁移的影响　各组MC 的
平均移动距离(μm )见表2。

结果表明,抗MCP 21抗体
能明显抑制H UGEC 的条件培养基所致MC 的迁移(P <0.01)。

表2　抗MCP21抗体对H UGEC的条件培养基所致MC迁移的影响
T ab2　The effect of anti2MCP21antibody on MC migration induced by conditioned medium for H UGECs
(n=30,x±s) G roup M igratory distance(μm)
　N on2conditioned medium28.2±1.6
　N on2conditioned medium+Ab30.0±1.2a
　C onditioned medium57.5±1.5
　C onditioned medium+Ab10.2±1.7b
　P ositive control73.2±1.9
　P ositive control+Ab34.1±1.0c
a P<0.05vs non2conditioned medium;
b P<0.01vs conditioned medium group;
c P<0.01vs positive control group.
3　讨论
本研究显示,正常情况下H UGEC可表达极少量的MCP21,可能与维持其生理功能有关。

高浓度的糖作用后MCP21的表达增强,且有时间依赖性。

H UGEC的条件培养基所致MC的迁移为一种趋化作用,而非化学促动作用,提示其可能分泌MCP21。

抗MCP21抗体能明显抑制条件培养基所致黏MC的迁移,提示H UGEC的条件培养基中存在MCP21。

本实验中,抗MCP21抗体对MC趋化作用的抑制率为47%。

与文献5报道的30%～60%相似。

已知T NFα、I L21、G M2CSF、M2CSF和TG F2β也具有趋化活性6,7,因此,本实验的结果不排除H UGEC在高浓度的糖刺激下产生的这些细胞因子或其他趋化因子对MC的趋化作用。

但我们认为,MCP21可能是主要的趋化因子,因为在H UGEC的条件培养基中,加入抗MCP21抗体后,其可明显降低MC的趋化活性。

糖尿病肾病的发病机制一直是研究的热点,通过本实验我们推测,高浓度的糖所引起的肾脏MCP21表达的增加,可能是其发病机制之一。

MCP21是趋化、激活MC的主要趋化因子,属于趋化因子β家族成员之一。

MCP21可趋化MC至炎症部位并激活MC 中的溶酶体酶以及产生氧自由基、I L21和I L26等炎症介质,并调节MC膜表面黏附分子C D11/C D18的表达8,使MC的黏附性增强而加重组织损伤。

在链脲佐菌素(streptoztocin)诱导的糖尿病大鼠中,观察到系膜区MCP21的表达增强,并伴随MC数量增多和细胞外基质积聚增加。

另有学者9观察到,糖化血红蛋白可以剂量、时间依赖性地促进培养的人系膜细胞表达MCP21,并推测其可促进系膜细胞表达MCP21,可能有助于糖尿病肾病地发病和进展。

以上资料进一步支持MCP21是糖尿病肾病发病的关键因素之一。

本研究中,我们发现体外应用抗MCP21抗体,可部分地抑制MC的趋化活性。

提示抗MCP21抗体有一定的辅助治疗价值。

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