生物化学--实验十血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析

实验十血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析【目的意义】
1.了解电泳带中脂蛋白显色特点。

2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。

3.掌握正常人血清脂蛋白的分类。

【实验原理】
琼脂糖是经过挑选、以质地较纯的琼脂作为原料而制成的。

琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物，为一种含硫酸根、带负电荷的多糖类物质，具有离子交换性质，这种性质对电泳及凝胶过滤具有不良影响。

琼脂是直链多糖，它由D-半乳糖和3，6脱水L-半乳糖的残基交替排列组成。

琼脂糖主要通过氢键形成凝胶。

电泳时，因为凝胶中含水量大（98～99%），近似自由电泳，固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。

而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。

血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。

各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。

因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。

琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。

将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。

再将预染过的血清用滤纸插条法（或其它方法）置于琼脂糖凝胶板上进行分离。

通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。

【实验准备】
一、器材
1.电泳仪、电泳槽
2.76×26mm载玻片
3.台式离心机
4.水浴锅
5.15mm宽刀片
6.镊子及剪刀
二、试剂
1.苏丹黑染色液将苏丹黑B加到无水乙醇中至饱和，振荡使其乙基化，用前过滤。

2.巴比妥缓冲液称取巴比妥钠15.4g，巴比妥2.76g及EDTA 0.29g，加水溶解后，再加蒸馏水定溶至1,000ml（pH为8.6，离子强度0.0075），作为电极缓冲液。

3.凝胶缓冲液称取三羟甲基甲烷（Tris）1.212g,EDTA 0.29g及NaCl5.85g,用蒸馏水溶解后，稀释至1,000ml，调pH至8.6。

4.琼脂糖凝胶称取琼脂糖0.50g溶于50ml凝胶缓冲液中，再加水50ml，在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。

【实验操作】
1.预染血清血清0.2ml中加苏丹黑色液0.02ml，混合置37℃水浴中染色30分钟，离心（2，000转/分）5分钟。

然后剪一细滤纸条，长15mm，宽约1～2mm，放入染过色的血清中预染。

2.制备琼脂糖凝胶板将已配制好的0.50%琼脂糖凝胶于水浴中加热融化，用吸管吸取约3ml凝胶溶液浇注在载玻片上，静置半小时待其凝固（天热时需延长，也可放入冰箱内数分钟以加速凝固）。

3.插滤纸法在已凝固的琼脂糖凝胶距一端2cm处，用宽约15mm之刀片垂直切入凝胶板，用滤纸吸去水分，然后将预染的血清滤纸条插入凝胶板的切口处。

4.电泳将凝胶板平行放入电泳槽中，样口端置负极。

用四层滤纸于巴比妥缓冲液浸湿，然后轻轻盖贴在凝胶板两端，滤纸的另一端则浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中。

接通电源，电压为120～130V，每片凝胶板电流为3～4mA。

经电泳35～50分钟，即可见到分离的区带。

5.如果需要保留电泳图谱，可将电泳后的凝胶板放入干胶机中制成干胶片。

若无干胶机，可用玻璃纸包好凝胶板（连同载玻片），其上平铺多层吸水滤纸，滤纸上再压上书等重物，吸干凝胶中的水分。

也可将凝胶板先放入清水中浸泡脱盐2小时，然后放烘箱（80℃左右）中烘干，但应陋随时注意温度的变化以及凝胶的脱水程度，以避免凝胶在脱水过程中龟裂。

【注意事项】
1.预染血清与温度有关，低温着色慢，高温着色快，37℃较为适宜。

2.浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一，否则会影响脂蛋白的分离效果。

4.将凝胶板放入电泳槽中，应切记与电力线平行、样品端置负极、搭桥滤纸不能搭在样品上。

5.制备干胶时，要严控制脱水的温度和速度，避免脱水时温度过高、速度太快引起凝胶收缩龟裂。

【思考题】
1.琼脂糖凝胶电泳有哪些操作要点？
2.电泳之后琼脂糖凝胶板如果用溴酚蓝染色，将出现何种情况？
3.为什么正常人血清脂蛋白电泳时见不到乳糜微粒区带？
4.琼脂糖凝胶有哪些注意事项？
5.如何制作琼脂糖凝胶电泳图谱干胶片？。