嗜热栖热菌的发酵工艺优化及菌剂制备

乔鹏阔，吕周亚，彭
霞，等.嗜热栖热菌的发酵工艺优化及菌剂制备［J ］.中南农业科技，2024，45（3）：60-64．
嗜热菌又称为高温菌或嗜热微生物，是一种可以在高温环境下生长繁殖的微生物，广泛存在于火山、温泉、堆肥堆体以及地热区土壤等地区。

根据最适生长温度的不同，可将嗜热菌分为耐热菌（45~55℃）、兼性嗜热菌（55~65℃）、专性嗜热菌（65~70℃）、极端嗜热菌（70~80℃）以及超嗜热菌（80~
110℃）［1］。

大多数极端嗜热菌属于化能无机自养型
细菌，以CO 、CO 2、CH 4作为碳源，通过有氧呼吸或无氧呼吸获得能量［2］。

嗜热栖热菌分布范围广，生长能力强，在民用热水、温泉、火山、堆肥堆体以及地
热区土壤均有发现［3］。

极端嗜热菌是一种耐受极端高温的古老细菌，在地球的生命起源最初时期，地表温度高达100℃，极端嗜热菌得以大量生长繁殖。

自从20世纪70年代研究人员从美国黄石公园土壤中分离出第一株水生嗜热菌以来，大量的嗜热菌陆续被发现，且从嗜热菌中分离的酶被应用于科学研究，如从极端嗜热菌Thermus aquaticus 中提取出的Taq DNA 聚合酶被广泛应用于PCR 中，促进了基础生物学的发展［4］。

在皮肤护理和化妆品领域，嗜热栖热菌能产生稳定的超氧化物歧化酶（SOD ）和
B 族维生素，起到抵抗自由基侵害皮肤、延缓衰老的
功效。

另外，B 族维生素可以减轻皮肤炎症反应，抵抗日光损害，促进细胞再生［5］。

也有学者指出，在畜禽粪便堆肥的过程中添加极端嗜热菌，可以节省堆肥时间。

Wen 等［6］将嗜热微生物菌剂添加到好氧堆肥堆体中，结果表明其可以降低CH 4的排放量，并促进堆体腐殖化进程。

黄殿南等［7］在厨余垃圾好氧堆肥过程中添加嗜热菌剂，结果发现，在不添加热源的情况下，堆体平均温度达70℃，最高温度达84℃，发酵时间也降低到13d ，提高了堆肥的效率与质量。

微生物发酵一般指微生物利用发酵原料进行生长代谢，同时产生目的产品的过程。

微生物发酵工艺已被广泛应用于化学工业、食品工业、环境保护、医药工业、能源工业以及农业等多个领域［8］。

适宜的培养条件和培养基是微生物发酵工艺的基础和前提。

关于嗜热菌微生物发酵的研究较少，因此，本研究对嗜热栖热菌进行生长特性和生理生化特性研究，并对其发酵条件以及培养基进行优化，探究多种适合该菌生长的载体，并制作超高温发酵
收稿日期：2023-06-28
基金项目：武汉市农业科学院2023年创新体系科技强基项目（XKCX202302-4）；湖北省乡村振兴科技支撑项目（2022BBA145）；生猪疫病智能
化预警装备研发项目（2022BBA0015）
作者简介：乔鹏阔（2000-），男，河南郑州人，在读硕士研究生，研究方向为动物生产与畜牧工程，（电话）159****0793（电子信箱）qiaopeng⁃
************* ；通信作者，邓
兵，高级畜牧师，主要从事畜禽废弃物综合利用研究工作，（电子信箱）dengbing@whagri.
com ；蒋思文，教授，主要从事动物遗传育种研究工作，（电子信箱）******************** 。

嗜热栖热菌的发酵工艺优化及菌剂制备
乔鹏阔1，2
，吕周亚1，彭
霞2，邓兵2，蒋思文1，陈子豪3，刘会胜4，张子越5
（1.华中农业大学动物科学技术学院，武汉
430070；2.武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，武汉
430070；
3.武汉设计工程学院食品与生物科技学院，武汉
430070；4.枫林大坡府（湖北）农牧科技集团有限公司，湖北黄石
435000；
5.湖北大金龙农牧科技发展股份有限公司，湖北荆门
448000）
摘要：通过16S rRNA 基因序列测定、序列比对和系统发育树的构建确定嗜热栖热菌的分类学地位，并命名该菌株为Thermus thermophilus strain Q1。

对该菌进行生长特性和生理生化特性研究，并对其发酵条件以及发酵培养基进行优化，最后利用不同载体确定该菌最适介质并制作超高温发酵菌剂。

结果表明，该菌为G -好氧菌，V-P 试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验结果为阳性；吲哚试验、明胶穿刺试验以及H 2S 试验结果为阴性；该菌具有降解油脂和固氮的能力，不能降解纤维素、蛋白质和淀粉；该菌的最适培养条件是以嗜热栖热菌培养基为基础，分别添加1%的乳糖、水解酪合蛋白、Mg 2+作为菌株生长的碳源、氮源和无机盐离子，初始pH 为7，接种量为4%，摇床转速为180r/min ，装液量为10%，发酵温度75℃；以生物炭作为发酵菌剂载体，48h 培养OD 600nm 可达1.23。

关键词：嗜热栖热菌；发酵工艺；优化；菌剂制备中图分类号：TQ929
文献标识码：A
文章编号：2097-2083（2024）03-0060-05
第3期
菌剂，对于提高嗜热栖热菌发酵效率，降低嗜热栖热菌发酵成本具有重要意义，同时为生产应用提供参考。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株嗜热栖热菌菌株购于北纳生物公司。

1.1.2培养基嗜热栖热菌培养基（1L）：酵母粉4g、聚蛋白胨8g、NaCl2g、高强度琼脂20g。

1.1.3试剂与仪器
1）试剂。

酵母粉、聚蛋白胨、NaCl、高强度琼脂、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉、水解酪合蛋白、蛋白胨、尿素、牛肉膏聚蛋白胨、MgCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2（国药集团化学试剂有限公司）。

2）仪器。

UV754N型紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；SH2-A型水浴恒温振荡器（常州诺基仪器有限公司）；A14031065型超净工作台（广州市鹏鑫科学仪器有限公司分公司）；Veriti™96孔PCR仪（赛默飞世尔科技有限公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.2试验方法
1.2.1菌株活化将菌种从-80℃取出，置于冰上融化，随后吸取2mL至新培养基中，75℃、180r/min 条件下培养，待其浑浊，随后可进行传代培养。

1.2.2菌株的形态观察将嗜热栖热菌活化后，在固体平板培养基上划线，75℃培养24h观察菌落形态。

挑取单菌落，对其进行革兰氏染色，通过光学显微镜观察菌体形态并进行革兰氏分析。

1.2.3菌株的分子生物学鉴定采用细菌通用引物27F和1492R扩增16S rRNA基因序列，并对产物进行测序。

将测序结果在NCBI上进行序列比对，并用MEGA11软件中的Neighbor joining法构建系统发育树，判定菌株的分类。

1.2.4菌株的生理生化指标检测将菌种接种到嗜热栖热菌培养基上75℃培养24h，参考《伯杰细菌鉴定手册》［9］进行生理生化与生长特性检测，并记录结果。

1.2.5菌株生长特性检测菌株的淀粉降解试验、蛋白质水解试验、纤维素降解试验、油脂水解试验以及固氮试验参考《常见细菌系统鉴定手册》［10］试验方法进行，并记录结果。

1.2.6菌株生长曲线测定将菌液在75℃、180r/min 恒温水浴摇床过夜振荡培养。

以4%的接种量转接入新的嗜热栖热菌培养基中，在75℃、180r/min的恒温水浴摇床中培养，每间隔4h进行菌液OD600nm 的检测。

以时间为横坐标，OD600nm为纵坐标，绘制该菌株的生长曲线。

1.2.7菌株发酵培养条件优化
1）初始pH对菌种发酵培养的影响。

菌株生长的pH一般以7左右为宜，因此，调节发酵培养基初始pH范围为5~9，梯度为1进行发酵试验，48h后测定其OD600nm，确定其最适的初始pH。

2）摇床转速对菌种发酵培养的影响。

以4%的接种量接种于pH为7的培养基中进行发酵培养，分别设置恒温水浴摇床的转速为140、160、180、200、220r/min，温度为75℃的条件下进行48h发酵培养后测定其OD600nm，确定其最适的摇床转速。

3）接种量对菌种发酵培养的影响。

在50mL的离心管中分别以2%、3%、4%、5%、6%的接种量接种在10mL嗜热栖热菌发酵培养基中，在75℃、180 r/min的条件下进行48h发酵培养，测定其OD600nm，确定其最适的接种量。

4）装液量对菌种发酵培养的影响。

在50mL的离心管中分别以5%、10%、20%、30%、40%的装液量装入嗜热栖热菌的发酵培养基中，以4%的接种量接种菌液，在75℃、180r/min的条件下进行48h发酵培养，测定其OD600nm，确定其最适的装液量。

1.2.8菌株发酵培养基的优化
1）碳源单因子发酵培养基。

在发酵培养基的基础上，以聚蛋白胨为氮源，在嗜热栖热菌中加入不同碳源（蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖），其他条件不变，以4%接种量接种，并于75℃、180r/min下培养48h，检测发酵菌液的OD600nm，确定最佳的3个碳源。

2）氮源单因子发酵培养基。

在以酵母粉为碳源的基础上，分别选取水解酪合蛋白、蛋白胨、尿素、牛肉膏聚蛋白胨作为发酵培养基的氮源，其他条件不变，按4%接种量接种，并于75℃、180r/min 下培养48h，检测发酵菌液的OD600nm，确定最佳的3个氮源。

3）无机盐单因子发酵培养基。

在碳源、氮源分别为酵母粉和聚蛋白胨的基础上，分别选用NaCl、MgCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2作为发酵培养基的无机盐离子，其他条件不变，按4%接种量接种，并于75℃、180r/min下培养48h，检测发酵菌液的OD600nm，确定最佳的3个无机盐。

1.2.9正交试验分别选取最适的3个碳源、氮源、无机盐，构建L9（34）正交试验。

如表1所示，将碳源、氮源以及无机盐的3个不同水平按照正交试验设计进行添加，其他条件不变，于75℃、180r/min下培养48h，检测发酵菌液的OD600nm，确定最佳因素组合。

乔鹏阔等：嗜热栖热菌的发酵工艺优化及菌剂制备61
中南农业科技2024年
表1正交试验因素和水平
水平123
因素
碳源（A ）乳糖蔗糖葡萄糖
氮源（B ）水解酪合蛋白牛肉膏聚蛋白胨
蛋白胨
无机盐（C ）Mg 2+Na
+
Ca 2+1.2.10
超高温发酵菌剂的制备分别将高岭土、
生物炭、玉米面置于105℃烘箱烘干至恒重，用研钵研磨，过80目筛，得到较细的粉末备用。

将1%脱脂
奶粉保护剂加入到分离的菌株发酵菌液中，并搅拌均匀，按液∶固=1.5∶1.0的比例分别加入过80目筛的高岭土、生物炭和玉米面，于75~80℃超嗜热发酵装置中搅拌1h 。

抽滤去除多余滤液，并将滤渣置于
75℃烘箱烘干至恒重，烘干后的滤渣经过破壁机粉磨，过80目筛，获得嗜热栖热菌菌株粉末状的发酵菌剂。

1.2.11
菌剂OD 600nm 的检测
分别取高岭土、生物
炭、玉米面制备的发酵菌剂1g 加入10mL 的灭菌蒸馏水中，静置20min ，在200r/min 的摇床上充分振荡30min ，即成悬浊液，按4%接种量接种，并于75℃、180r/min 下培养48h ，检测发酵菌液的OD 600nm ，确定最佳发酵菌剂。

2
结果与分析
2.1
菌株的形态学观察
如图1所示，该嗜热栖热菌菌落颜色为乳黄色、
不透明、边缘不规则、表面隆起、干燥。

该菌为G -菌，镜检呈红色，菌体呈较长的杆状结构。

b
a.菌落形态；
b.革兰氏镜检结果
图1菌株形态学观察
2.2
菌株分子生物学鉴定
将16S rRNA 测序结果在BLAST 程序上进行
16S rRNA 核苷酸序列同源性比对，并构建系统发育
树。

如图2所示，该菌株（编号1、编号8）与嗜热栖热菌JCM 10941（Thermus thermophilus strain JCM 10941）的同源性达99.78%，初步确定该菌株为嗜热栖热菌Q1（Thermus thermophilus strain Q1）。

NR 113293.1Thermus thermophilus strain JCM 1094116S ribosomal RNA partial sequence
NR 037066.l Thermus thermophilus HB816S ribosomal RNA complete sequence 1
8NR 025901.1Thermus filiformis strain Wai3316S ribosomal RNA partial sequence
NR I17150.1Thermus filiforrmis strain DSM 4687I6S ribosomal RNA partial sequence
NR 1I7151.1Thermus filiformis strain DSM 468716S ribosomal RNA partial sequence
NR 1I7152.1Thermus filiformis strain DSM 4687I6S ribosomal RNA partial sequence NR 108218.l Thermus composti strain K-39I6S ribosomal RNA partial sequence
NR 116251.1Thermus arciformis strain TTH9216S ribosomal RNA partial sequence
NR 112160.1Thermus kanwarayensis JCM 12314strain KWlI 16S ribosomal RN4partial sequence NR 116442.1Thermus islandicus strain PRI-383816S ribosomal RNA partial sequence
NR 180714.1Thermus sediminis strain L198I6S ribosomal RNA complete sequence NR 179264.1Thermus sediminis strain L198I6S ribosomal RNA partial sequence
NR 025900.1Themus aquaticus strain YT-l 16S ribosomal RNA partial sequence
NR 036983.1Therrms brockiamus strain YS3816S'ribosomal RNA gene partial sequence
NR 026501.1Thermus igniterrae strain RF-416S ribosomal RNA partial sequence
NR 180407.1Themus thermamrylovorans strain CFH 7277316S ribosomal RNA partial sequence NR 132306.2Themus tengchongensis strain YIM 7792416S ribosomal RNA complete sequence NR 026502.1Thermus antranikianii strain HN3-716S ribosomal RN4partial sequence NR 024867.1Thermus scotoductus strain Se-I 16S ribosomal RNA partial sequence NR 181790.1Thermus brevis strain SYSU G0500116S ribosomal RNA partial sequence
100
97956441706710025
9421
671005976
93
9279图2嗜热栖热菌Q1物种发育树
62
第3期2.3菌株的生理生化与生长特性
由表2、表3可知，嗜热栖热菌革兰氏染色为红色，说明该菌为G -
好氧菌，V-P 试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验结果为阳性；吲哚试验、明胶穿刺试验以及H 2S 试验结果为阴性；该菌具有降解油
脂和固氮的能力，不能降解纤维素、蛋白质和淀粉。

表2菌株的生理生化特性
试验革兰氏染色V-P 试验
硝酸盐还原试验
吲哚试验过氧化氢酶试验明胶穿刺试验H 2S 试验结果-++-+--注：“-”代表试验结果为阴性；“+”代表试验结果为阳性。

表3同
表3菌株的生长特性
试验淀粉降解试验蛋白质水解试验纤维素降解试验油脂水解试验固氮试验
结果---++
2.4
菌株的生长曲线
如图3所示，嗜热栖热菌生长呈现出典型的“S ”形增长趋势，0~4h 为生长迟缓期，4~20h 为生长对数期，20~48h 为生长稳定期。

1.51.20.90.60.30
O D 600n m
10
2030
40
50
时间//h
图3嗜热栖热菌生长曲线
2.5菌株发酵培养条件优化
如图4所示，嗜热栖热菌菌株的最适发酵培养
条件为初始pH 7、接种量4%、摇床转速180r/min 、装液量10%、发酵温度75℃。

2.6
菌株发酵培养基优化
通过单因素试验设计，分别将不同的碳源、氮源、无机盐离子添加到嗜热栖热菌发酵培养基中，结果如图5所示，该菌株最适合利用的碳源为乳糖，氮源为水解酪合蛋白，无机盐离子为Mg 2+。

2.7正交试验
为了探究发酵培养基碳源、氮源、无机盐最优
组合，在单因素试验的基础上，设计L 9（34
）
正交试验，结果（表4）表明，从3个因素来看，结合R （因素
极差值）的大小对比可知，因子2（氮源）对嗜热栖热菌生长的影响最大，其次是因子3（无机盐），最后是因子1（碳源）。

因此，3个因素的影响大小排序为因子2>因子3>因子1。

图4
嗜热栖热菌菌株发酵培养条件优化
图5嗜热栖热菌菌株发酵培养基优化
5
6
7
8
9
pH
1.00.80.60.40.20O D 600n m
1.31.21.11.00.90.8
0.7
O D 600n m
140160180200220
转速//r/min
1.161.121.081.041.00
O D 600n m
2
345
6
接种量//%
2.11.81.51.20.90.6O D 600n m
10203040
装液量//%
1.51.20.90.60.30
O D 600n m
葡萄糖乳糖果糖
蔗糖
碳源
1.20.90.60.30
O D 600n m
1.61.20.80.4
O D 600n m
尿素牛肉膏聚蛋白胨
蛋白胨水解酪合蛋白氮源
Fe 2+Ca 2+
Na +Mg 2+
无机盐
乔鹏阔等：嗜热栖热菌的发酵工艺优化及菌剂制备
63
中
南农业科技2024年
表4
正交试验设计与极差分析结果
项目123456789K 1K 2K 3R
碳源（A ）
1112223332.181.921.021.16
氮源（B ）
1232313122.770.971.371.80
无机盐（C ）
1233122312.201.881.031.17
OD 600nm
1.200.760.300.040.910.960.150.690.17
结合各因子的最佳水平可知，因子1以第1个水平乳糖最优，因子2以第1个水平水解酪合蛋白最优，因子3以第1个水平Mg 2+最优。

综合上述分析可知，发酵培养基中对嗜热栖热菌菌株生长影响最大的是氮源，最优组合为乳糖碳源、水解酪合蛋白氮源、Mg 2+
无机盐。

2.8
超高温发酵菌剂的制备及其效果检测分别使用高岭土、生物炭、玉米面制作嗜热栖热菌发酵菌剂，并测定其48h 发酵菌液OD 600nm ，结果（图6）表明，生物炭为最佳发酵菌剂载体，48h 发酵菌液OD 600nm 可达1.23。

1.51.20.90.60.30
O D 600n m
生物炭
玉米面
高岭土
发酵菌剂
图6不同嗜热栖热菌超高温发酵菌剂的筛选3讨论
发酵是将微生物大规模应用于工业生产的基
础和前提，而探寻微生物发酵最适条件对于提高发酵效率和降低发酵成本具有重要意义
［11］。

pH 是影
响菌株发酵的重要因素，与菌株生长代谢相关的酶都要在最适pH 条件下才能更好地发挥作用，pH 过高或过低均会影响其活性；装液量和接种量主要影响菌株发酵过程中的O 2含量，较低的O 2含量不利于菌株的生长，而较高的O 2含量又会造成大量细菌的繁殖并竞争营养物质，导致营养物质缺乏，不利于发酵；合适的转速有利于细菌对O 2和培养基中营养
物质的吸收利用，但转速过高可能会导致菌体破
裂，影响发酵。

微生物固态菌剂的制备有利于延长菌剂保存期、防止菌剂失活、方便存储和运输，对于提高微生物发酵效率具有重要意义［12］。

嗜热栖热菌在自然环境中存活率较低且难以保存，因此，开发嗜热栖热菌的发酵菌剂具有重要意义。

本研究以生物炭、玉米面、高岭土为发酵菌剂载体，研究了不同载体对嗜热栖热菌的影响，发现生物炭作为载体效果最好，发酵后菌液的OD 600nm 可达1.23。

可能是因为生物炭属多孔性物质、孔隙结构表面积大，可以使菌体快速附着于载体材料的吸附位点，能够更好地为菌体提供保护［13］。

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64。