白藜芦醇对VDAC1的去磷酸化修饰在心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用研究

摘要
摘要
目的：
前期研究证实，位于线粒体外膜上VDAC1蛋白介导了mPTP的开放，白藜芦醇可以影响VDAC1的活性。

但具体机制尚不清楚。

本实验的目的在于研究白藜芦醇预处理对A/R损伤后的H9c2心肌细胞VDAC1蛋白磷酸化的影响以及与Akt-GSK3β通路的关系。

方法：
本实验用H9c2细胞株为实验对象，模拟体内缺血再灌注损伤模型，构建缺氧复氧损伤模型。

采用免疫印迹(Western Blotting)法检测phospho-Akt(Ser473)、Akt、phospho-GSK3β(Ser9)、GSK3β、VDAC1蛋白的表达；免疫共沉淀(Co-ip)法和Western Blotting 法检测VDAC1磷酸化蛋白水平，以及HK2、Bax与VDAC1的结合；分光光度法测定CPK、LDH的活性；线粒体膜电位(Δψm)、活性氧(ROS) 和细胞凋亡由流式细胞仪测定。

结果：
1.A/R损伤后，p-VDAC1、VDAC1蛋白表达量较正常组显著上调,Bax与VDAC1蛋白结合量增加；p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9) 蛋白表达量明显降低，HK2与VDAC1 蛋白结合量大量减少(p<0.01)；
2. 白藜芦醇预处理后，p-VDAC1蛋白较A/R组明显下调，Bax与VDAC1蛋白结合量大幅降低；p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9) 蛋白表达量较A/R组显著上调，HK2与VDAC1 蛋白结合量明显增加(p<0.01)；
3.与白藜芦醇预处理组比较，加入Akt特异性抑制剂Akt inhibitor IV后明显抑制AKT-GSK3β通路，VDAC1磷酸化水平明显上升，CPK 和LDH活性显著升高，细胞内ROS大量爆发，Δψm稳定性显著下降，细胞凋亡数明显增多(p<0.01)。

结论：
白藜芦醇预处理通过激活Akt-GSK3β通路降低VDAC1蛋白磷酸化水平，从而抑制线粒体凋亡通路，对抗心肌缺氧复氧损伤。

关键词：白藜芦醇；VDAC1；磷酸化；Akt-GSK3β通路；A/R；心肌细胞
摘要
资助项目：国家自然科学基金资助项目(81460495)
Abstract
ABSTRACT
Objective: As we previously demonstrated, VDAC1, a protein located in the mitochondrial outer membrane, is involved in the effects of resveratrol on mitochondrial permeability transition pore (mPTP). However, the regulation mechanism remains obscure. In this study, we aim to explore the effect of resveratrol on VDAC1 phosphorylated modification and the relationship with Akt-GSK3β pathway in H9c2 cardiomyocytes subjected to anoxia/reoxygenation (A/R) injury.
Methods: In this study, an in vitro I/R model was replicated on H9c2 cardiomyocytes by A/R treatment. p-Akt(Ser473), Akt, p-GSK3β(Ser9), GSK3β, VDAC1 protein expression were detected by Western Blotting; p-VDAC1, HK2-VDAC1 complexes,and Bax-VDAC1 complexes expression were detected by Co-Immunoprecipitation. According to the kit, the activity of CPK, LDH were measured by UV spectrophotometer. The levels of intracellular ROS, mitochondrial membrane potential (Δψm) and apoptosis were detected by flow cytometry.
Results: 1.After A/R injury, the expression of VDAC1, p-VDAC1 and Bax-VDAC1 complexes expression were increased compared with control group,the expression of p-Akt(Ser473), p-GSK3β(Ser9) and HK2-VDAC1 complexes were remarkably dropped compared to control group(p<0.01). 2.Preconditioning with Resveratrol, the expression of VDAC1, p-VDAC1 and Bax-VDAC1 complexes expression were dropped compared with A/R grou, the expression of p-Akt(Ser473) , p-GSK3β(Ser9) and HK2-VDAC1 complexes were remarkably increased compared to A/R group (p<0.01). 3.To compared with Resveratrol pretreatment group, Akt-GSK3βpathway was inhibited when used the specific inhibitor of Akt inhibitor IV, come with VDAC1 phosphorylation level was rised, the cell viability was remarkably decreased, the activity of CPK and LDH were ascended . While VDAC1 de-phosphorylated modification were inhibited by Akt inhibitor IV, A/R injury would induced ROS generation, decreased the stability of Δψm, increased the release of cytochrome c from the mitochondria into cytosol and finally induced cell apoptosis (p<0.01).
Abstract
Conclusion: Resveratrol activates Akt-GSK3βpathway, prompts VDAC1 de-phosphorylated modification, subsequently inhibit the mitochondrial apoptosis pathway, reduce cell apoptosis, finally protects cardiomyocytes against A/R injury.
Key Words:Resveratrol; Anoxia/reoxygenation; VDAC1; phosphorylated modification; Akt-GSK3β pathway; H9c2 cardiomyocytes
This study was supported by the Natural Scientific Foundations of China (81460495).
目录
目录
第1章引言 (1)
第2章材料与方法 (4)
2.1主要材料及试剂 (4)
2.2实验主要仪器和设备 (5)
2.3 实验方法 (6)
2.3.1 H9c2心肌细胞的培养 (6)
2.3.2 H9c2心肌细胞体外缺氧复氧(A/R)损伤模型的构建 (8)
2.3.3 实验分组及处理 (8)
2.3.4免疫印迹(Western Blotting)法检测H9c2心肌细胞中相关蛋白的表达
(9)
2.3.5免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)法检测H9c2心肌细胞中磷酸
化VDAC1及相关蛋白的表达 (13)
2.3.6 观察指标及方法 (14)
2. 4 数据处理 (17)
第3章结果 (18)
3.1白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后VDAC1磷酸化蛋白的影响
(18)
3.2白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后p-AKT和AKT蛋白的影
响 (19)
3.3白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后p-GSK3β和GSK3β蛋白
表达的影响 (20)
3.4 加入Akt inhibitor IV后，白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后
VDAC1磷酸化蛋白的影响 (21)
3.5加入Akt inhibitor IV 后，白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后
HK2-VDAC1蛋白水平的影响 (22)
3.6加入Akt inhibitor IV后，白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后
Bax-VDA V1蛋白表达的影响 (23)
3.7加入Akt inhibitor IV后，白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后
目录
LDH和CPK活性的影响 (24)
3.8加入Akt inhibitor IV后，白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后
ROS水平的影响 (25)
3.9加入Akt inhibitor IV后，白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后
线粒体膜电位(ΔΨm)的影响 (26)
3.10加入Akt inhibitor IV后，白藜芦醇预处理对H9c2心肌细胞A/R损伤后
细胞凋亡水平的改变 (27)
第4章讨论 (28)
第5章结论与展望 (31)
5.1 结论 (31)
5.2 展望 (31)
致谢 (32)
参考文献 (33)
综述 (37)
英文缩写及全称和中文对照表
英文缩写及全称和中文对照表
英文缩写英文全称中文全称A/R anoxia/reoxygenation 缺氧/复氧
Bcl-2 I/R HK2 B-cell lymphoma 2
ischemia/reperfusion
Hexolinase 2
B-细胞淋巴瘤基因2
缺血/再灌注
己糖激酶
Cyt c Cytochrome c 细胞色素c
CPK creatine phosphokinase 肌酸磷酸激酶DMSO Diphenylamine 二甲基亚砜
DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇
DCFH dichlorodihydrofluorescein Diacetate 2′,7′-二氢二氯荧光素ddH2O Distillation- Distillation H2O 二蒸水
ECL Enhanced chemiluminescence 增强化学发光剂EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸
Akt
inhibitor
Akt inhibitor IV Akt特异性抑制剂FBS Fetal bovine serum 胎牛血清
FITC Fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素
Gly Glycine 甘氨酸
GSH-Px glutathione peroxidase 谷胱甘肽过氧化酶HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)1-piperazine
ethanesulfonic acid
N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2-
乙烷磺酸
Co-IP Co-Immunoprecipitation 免疫共沉淀法
JC-1 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzi
mida-zolo carbocyanine iodide
线粒体膜电位检测染料
LDH lactate dehydrogenase 乳酸脱氢酶
mPTP mitochondria permeability transition pore 线粒体通透性转换孔MEM Eagles minimum essential medium Eagle培养基
英文缩写及全称和中文对照表
OD Optical Density 光密度
PMSF phenylmethyl sulfonylfluoride 苯甲基磺酰氟化物PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS phosphate buffer saline 磷酸缓冲液
PVDF Polyvinylidene fluoride 聚偏氟乙烯膜
PI Propidium iodide 碘化丙啶
Res Resveratrol 白藜芦醇
ROS Reactive oxygen species 活性氧
rpm revolution per minute 每分钟转数
SEM Standard Error of Mean标准误
SDS Sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠TEMED N,N,N,N-tetramethylethyl- enediamine N,N,N,N-四甲基乙二胺Tween 20 Polyoxyethylen sorbitan monolaurate 吐温-20
Tris Trihydroxymethylaminomethane 三羟甲基氨基甲烷VDAC V oltage-dependent anion channel 电压依赖性阴离子通道
第1章引言
第1章引言
心肌缺血再灌注（I/R）损伤会造成再灌注心率失常，心肌酶释放，严重的心肌内出血[1]。

有研究发现，导致心肌I/R损伤的主要原因是恢复血液供应后，组织细胞内ROS大量爆发，引起钙超载。

活性氧与受损心肌细胞或坏死心肌细胞溶解物质反应引起并加重组织细胞的功能紊乱和代谢障碍，最终导致组织细胞凋亡甚至坏死[2]。

缺血预适应和药物预适应均可有效减轻心肌I/R损伤[3,4]。

心肌I/R损伤机制涉及信号通路非常多，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤发病过程[5]。

流行病学调查发现，法国人虽喜好高脂饮食，但居民冠心病的发病率和死亡率都比其他国家显著偏低。

这一“法国奇迹”引起广泛关注，经过大量研究发现，这与法国人日常大量饮用葡萄酒有关[6]。

而葡萄酒中的白藜芦醇(Resveratrol, Res)是发挥这种心血管保护作用的主要功能因子，目前已在葡萄、虎杖、花生、松树、桑葚和决明子等多种植物中发现了该成分[7]。

白藜芦醇作为一种植物抗毒素和非黄酮类化合物自从被发现以来，一直受到医学相关专业研究者的重视，其中抗氧化[8]、抑制炎症[9]、舒张血管[10]、抗血小板聚集[11]和抑制血管新生[12]等多种药理学活性已得到研究证实。

对预防和治疗心脑血管系统疾病具有非常重要的临床意义。

我们先前的实验研究发现,长期摄入白藜芦醇的大鼠在一定程度上能够对抗心肌I / R损伤,其跟抑制了线粒体上的线粒体渗透性转换孔(mitochondrial-permeability transition pore ，mPTP)的开放紧密相关[13]。

线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放被认为是再灌注损伤从可逆转变为不可逆的关键原因[14]。

mPTP是一个跨膜复合孔道，持续开放会导致完整的线粒体去极化、大量的线粒体肿胀和线粒体外膜破裂,最终导致细胞凋亡或坏死[15]。

因此,抑制mPTP开放能够对抗I/R损伤。

mPTP膜上有多种蛋白，例如亲环蛋白D(CypD)、线粒体Aβ（A13）、VDAC等蛋白[16]；其中VDAC不仅影响着离子和代谢物转运，而且其蛋白表达程度高低和活性都调控着mPTP的开放和关闭，以致影响I/R损伤程度[17]。

前期研究发现，H9c2心肌细胞缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation, A/R)损伤后，VDAC1蛋白表达量显著增加，mPTP开放，细胞大量凋亡；而细胞用白藜芦醇预处理之后再进行A/R损伤，这种现象得到
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第1章引言
了改善，VDAC1蛋白表达下调，mPTP开放程度大幅减小，线粒体膜电位更稳定，细胞凋亡数量显著减少，心肌细胞得到保护，这表明白藜芦醇对抗A/R损伤机制与VDAC1密切相关[18]。

但是，白藜芦醇对VDAC1蛋白的调节机制尚不清楚。

大量研究已经证实, VDAC1介导的mPTP开放及线粒体的功能，以及与其他蛋白质的相互作用，与其翻译后修饰密切相关[19]。

翻译后修饰是蛋白质活动、功能的主要调节方式。

包括乙酰化、磷酸化、亚硝基化和甲基化等修饰方式；其中磷酸化在信号转导、基因表达、代谢和生存调节中扮演着尤为重要的角色[20]。

在哺乳动物细胞里，有三分之一蛋白质在丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的位置上进行了磷酸化修饰[21]。

VDAC1蛋白通过翻译后修饰，能精确并完善地调控mPTP 开放；目前认为磷酸化是VDAC1最主要的翻译后修饰方式之一[22]。

在小鼠的肝脏细胞内，以及血管内皮细胞内，发现大量VDAC1蛋白进行了磷酸化修饰。

但暂时没有在正常心肌细胞里发现这种现象。

大量国内外研究也发现白藜芦醇发挥抗氧化、抑制炎症和保护心脑血管等诸多功能中均与调节靶蛋白翻译后修饰有关[23-24]。

因此我们推测，在心肌缺血再灌注损伤时，白藜芦醇极有可能通过影响VDAC1磷酸化修饰而调节其活性。

在ZA YD 等的文章中我们发现，白藜芦醇可以通过激活Akt-GSK3β通路来达到保护糖尿病心肌细胞的作用[25]，Akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与各种细胞过程，细胞存活、糖代谢，及细胞蛋白质合成都与其活性密切相关。

糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是一个广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞信号转导、蛋白质合成、细胞增殖、分化、粘附和凋亡[26]。

GSK-3β作为Akt下游靶点，其生物活性也受Akt调节，Akt（Ser473）磷酸化后Akt活性提高，并促进GSK-3β丝氨酸残基（Ser9）磷酸化，从而抑制GSK-3β活性，达到保护糖尿病心肌细胞的功效。

Maolong Dong等文章中我们发现利用Akt激活剂激活Akt-GSK3β通路可以减轻脂多糖诱导的心脏功能障碍[27-29]。

Lei Li等文章中发现k5（人纤溶酶原）抑制Akt-GSK3β通路促进VDAC1磷酸化可以诱导血管内皮细胞凋亡[30]。

在Cecile Marte等人的文章中发现非酒精性脂肪性肝病肝细胞里，Akt-GSK3β通路介导了VDAC磷酸化，调控了细胞凋亡与损伤程度[31]。

所以我们推测白藜芦醇对抗I/R损伤的线粒体机制可能是通过Akt-GSK3β通路介导VDAC1去磷酸化。

综上所述，本实验拟以H9c2心肌细胞为实验对象，运用免疫沉淀法和
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第1章引言
Western Bloting法等研究技术和手段，探讨白藜芦醇对抗A/R损伤的线粒体分子生物学机制，阐明其是否通过激活Akt-GSK3β通路影响VDAC1磷酸化修饰实现对mPTP的调控，为进一步阐明缺血性心肌损伤时细胞内信号传递机制和寻找新药物作用靶点奠定理论与实验基础，为研究和开发防治心血管系统疾病药物提供新思路。

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第2章 材料与方法
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第2章 材料与方法
2.1主要材料及试剂
白藜芦醇 ( Resveratrol, Res) 大鼠心肌样细胞(H9c2细胞株) 中国药品生物制品检定所 中国科学院细胞库 高糖DMEM 培养基(含双抗) 北京Solarbio 生物 胎牛血清 美国Gibco AKT inhibitor
德国 Calbiochem 1×PBS 缓冲液粉末(1000ml) 普洛立德生物技术 1×PBS 缓冲液(无菌) 北京Solarbio 二甲基亚砜(DMSO) 北京Solarbio 胰蛋白酶 美国Sigma 甘油 北京Solarbio VDAC1一抗
美国Santa Cruz 蛋白裂解液(RIPA 基础液) 北京Solarbio 叠氮钠
北京Solarbio Protein G Plus/Protein A Agarose Suspension 德国 Calbiochem Anti-phosphoserine/threonine antibody 英国Abcam p-Akt 一抗 Akt 一抗 p-GSK3β一抗 GSK3β一抗 美国Santa Cruz 美国Santa Cruz 美国Santa Cruz 美国Santa Cruz
β-actin 多克隆抗体 美国Santa Cruz HK2一抗 美国Santa Cruz Bax 一抗
美国Santa Cruz Goat anti-Mouse IgG ,HRP conjugated 北京中杉金桥生物技术 Goat anti-Rabbit IgG ,HRP conjugated 北京中杉金桥生物技术 Rabbit anti-Goat IgG ,HRP conjugated 北京中杉金桥生物技术 过硫酸胺
上海生工
第2章 材料与方法
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硫酸十二烷基钠(SDS) 美国Amersham 丙烯酰胺
美国Sigma N, N´-亚甲双丙烯酰胺 美国Biomol 聚氧乙烯山梨糖醇(Tween-20) 美国Amersham 甘氨酸(Glycine)
美国Sigma ECL 化学荧光试剂盒0164 上海硕嘉生物科技 四甲基乙二胺(TEMED) 美国Sigma
预染蛋白Marker 美国Thermo scientific HEPES
美国Sigma CPK 和LDH 试剂盒 南京建成生物科技 蛋白5 ×上样缓冲液 北京Solarbio 生物 葡萄糖(Glucose) 美国Sigma PVDF 膜
美国Milipore 苯甲磺酰氟(PMSF) 美国Sigma 溴酚蓝 (Bromophenol blue) 美国Amersham 考马斯亮蓝G250 丽春红 ROS 试剂盒
美国 Sigma 美国Amersham
北京碧云天 线粒体膜电位(JC-1) 检测试剂盒 Annexin-V-FITC 凋亡试剂盒 南京KeyGEN BioTECH 南京KeyGEN BioTECH
2.2实验主要仪器和设备
微量取样器
德国Eppendorf SW-CJ-2FD 型超净化工作台 苏州净化设备 倒置显微镜 日本Olympus 垂直电泳仪 美国Bio-Rad 旋涡振荡器
Kylin-Bell
第2章材料与方法
5804-R低温高速离心机德国Eppendorf
SmartSpec Plus核酸蛋白分析仪美国Bio-Rad
脱色摇床北京六一仪器厂
680型酶标仪美国Bio-Rad
全波长酶标仪Thermo scientifice
DYY-Ⅱ型稳压电源北京市六一仪器厂
PHS-25型pH计Mettler-Toledo中国
-80℃超低温箱日本Sanyo
AE360电子天平上海第三分析仪器厂
电子天平Mettler-Toledo中国
流式细胞仪(FCM) 美国Beckman
电热恒温培养箱日本Sanyo
A/R密闭装置长沙长锦应用技术研究所
N2-CO2-空气混合器上海瀚元流体设备有限公司
超纯水仪美国Millipore
LDZX-50FBS型灭菌锅上海申安医疗器械厂
MCO-15AC型二氧化碳培养箱日本Sanyo
2.3 实验方法
2.3.1 H9c2心肌细胞的培养
2.3.1.1 主要试剂
A. 细胞用无菌1×PBS缓冲液每瓶500ml：
直接从试剂公司购买
B. H9c2心肌细胞培养基：
500ml含双抗(青霉素+链霉素)高糖DMEM培养液+60ml胎牛血清，拧紧瓶盖，摇匀，置于4℃细胞试剂专用冰箱保存。

(培养基配制均须在超净台操作) C.细胞用各种型号移液管、离心管、冻存管和盖子均按规定标准清洗烘干并高压灭菌30min后再烘干使用。

2.3.1.2细胞培养
A. H9c2细胞的复苏
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第2章材料与方法
(1) 从液氮罐(-196℃)或-80℃冰箱中取出装有H9c2细胞的冻存管，1min内转移至37℃恒温水浴锅中，轻轻摇动，使之迅速融化。

(2) 快速将细胞转移至超净台，用大枪吸出转移至有5ml培养基的离心管中；2000rpm，离心5min，弃上清液。

(3) 向离心管中加入3-5ml培养基重悬细胞，用移液管轻轻吹打40-50次，将吹匀的细胞悬液均匀移种到10cm培养皿，补足培养液至10ml。

(4) 用“十字交叉法”前后、左右各摇80-100次，使细胞能够均匀分散在培养皿上，轻置于含有5%CO2浓度的37℃孵箱中培养。

B. H9c2细胞的传代
(1) 用显微镜观察细胞，当细胞在培养皿中的覆盖率达80%-95%时，移入超净台进行传代，弃去培养液，用无菌1×PBS缓冲液2-3ml清洗细胞2-3遍。

(2) 加入1ml含0.02%EDTA 胰蛋白酶(Trypsin)消化细胞，轻轻摇晃培养皿使Trypsin充分与细胞接触，当80%细胞变圆有少量细胞开始漂浮时加入3ml培养基终止消化。

(3) 用移液管反复吹打细胞40次，在显微镜下观察培养皿中细胞基本脱离时开始收集细胞悬液转移至离心管，2000rpm，离心4-5min，弃上清液。

(4) 在离心管中加入适量培养基(4-6ml)重悬细胞，用移液管轻轻吹打细胞40次，将细胞重悬液均分至新培养皿中，补足培养液至10ml。

(5) 用“十字交叉法”左右摇匀细胞，置于37℃孵箱中培养。

C. H9c2细胞的冻存
(1) 整体操作前，提前配制好适量细胞冻存液(FBS: DMSO=9: 1)，混匀，静置。

(2) 取形态良好细胞覆盖率达90%的培养皿，弃去培养液，用无菌1×PBS缓冲液清洗细胞3遍。

(3) 加入1ml含0.02%EDTA胰蛋白酶消化细胞，轻轻摇晃培养皿使胰酶与细胞充分接触，当80%细胞变圆少许细胞开始漂浮时加入3ml培养基终止消化。

(4) 用移液管反复轻柔吹打细胞，待培养皿上细胞基本吹下，收集细胞悬液至离心管，2000rpm，离心5min，弃上清液。

(5) 离心管中加入预先配好的冻存液，重悬细胞，将吹匀的细胞悬液均分至标记好的冻存管，盖紧冻存管盖后用封口膜封口，放置4℃ 0.5h，-20℃ 2h，-80℃过夜，次日放入液氮罐中保存。

以上细胞复苏、传代以及冻存等操作均须在超净台中进行（超净台预先照紫外
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第2章材料与方法
30min以上）。

2.3.2 H9c2心肌细胞体外缺氧复氧(A/R)损伤模型的构建
2.3.2.1 缺氧液和复氧液的配制
试剂模拟缺氧液模拟复氧液
pH 6.8 7.4
NaHCO3 6.0mM 20mM
NaCl 98.5mM 129.5mM
NaH2PO4 0.9mM 0.9mM
KCl 10.0mM 5.0mM
CaCl2 1.8mM 1.8mM
MgSO4 1.2mM 1.2mM
HEPES 20mM 20mM
Sodium lactate 40.0mM —
Glucose —55.0mM
2.3.2.2 H9c2心肌细胞的A/R模型[6]
取培养皿细胞覆盖率达90-95%的同一批细胞进行实验，弃去培养液，用PBS 洗两遍，最后用饱和模拟缺氧液(用95%N2和5%CO2混合气体饱和30min)润洗一次，在每个培养皿加入饱和缺氧液8ml，将所有培养皿放入37℃A/R密闭装置，并持续通入95%N2和5%CO2混合气体使细胞缺氧3h；待缺氧结束后，依次开始复氧步骤，用移液管弃去缺氧液，更换为等体积饱和模拟复氧液(用95%O2和5%CO2混合气体饱和30min)，置于37℃A/R密闭恒温装置中，并持续通入95%O2和5%CO2混合气体使细胞继续孵育2h（也可以通气半小时后夹闭气体）。

2.3.3 实验分组及处理
2.3.3.1白藜芦醇预处理对A/R损伤的保护作用
H9c2心肌细胞随机分为4组，每组重复相同实验4次。

前期研究发现，50μM 白藜芦醇为最佳给药浓度[21]。

本实验分组如下：
(1) 正常对照组(Control)：细胞弃去培养液，更换为未饱和模拟复氧液，放置到5%CO2，37℃恒温培养箱中孵育3h +2h。

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第2章材料与方法
(2) A/R组(A/R)：细胞弃去培养液，换饱和模拟缺氧液，将培养皿放入37℃A/R密闭装置，并通入95%N2和5%CO2混合气体使细胞缺氧3h；结束后再换为模拟复氧液（已饱和），置于37℃A/R恒温密闭装置中，并通入95%O2和5% CO2混合气体使细胞持续复氧2h。

(3) 50μM白藜芦醇预处理组(Res+A/R)：加50μM白藜芦醇，孵箱孵育24h后与A/R组同时做缺氧复氧处理。

(4) 白藜芦醇+Akt inhibitor组(Res+A/R+Akt inhibitor)：加0.5μM Akt inhibitor IV ，孵育24h后，加入50μM白藜芦醇，继续孵育24h，然后再与A/R组同时做缺氧复氧处理。

2.3.4免疫印迹(Western Blotting)法检测H9c2心肌细胞中相关蛋白的表达2.3.4.1 常用试剂的配制
(1) 1×PBS缓冲液(外用)：1×PBS缓冲液粉末，加适量二蒸水(ddH2O)搅拌至溶解后用ddH2O定容至1000ml，4℃保存备用。

(2) 30%丙烯酰胺储存液(30%Acr)：29.1g丙烯酰胺单体，0.9g N，N-亚基双丙烯酰胺，加60ml ddH2O搅拌溶解，后用ddH2O定容至100ml，最后用滤纸过滤并装入棕色瓶中，也可直接从试剂商处购买，4℃避光保存备用。

(3) Tris·HCl(pH 6.8) 溶液：12.1gTris，加80mlddH2O搅拌溶解后，用浓HCl 调pH值，边调pH值边加ddH2O定容，确保pH值为6.8，体积为100ml，4℃冰箱保存备用。

(4) Tris·HCl(pH 8.8) 溶液：18.12g Tris，加75ml ddH2O搅拌至溶解后，用浓HCl调pH值，边调pH值边加ddH2O定容，确保pH值为8.8，溶液体积为100ml，4℃冰箱保存备用。

(5) 10%十二烷基磺酸钠(10%SDS)：1.0g SDS，加7ml ddH2O摇匀，后置37℃恒温箱溶解，待气泡全消后定容至10ml，37℃恒温箱保存备用。

(6) 10%过硫酸胺(10%AP)：0.1g过硫酸胺，加1ml ddH2O溶解，现用现配，4℃保存备用。

(7) 电泳缓冲液：14.4g Glycine，3.0g Tris·HCl，1.0g SDS，加800ml ddH2O搅拌溶解，待充分溶解后，调pH值为8.3并定容至1000ml，室温保存备用。

(8) 转移缓冲液：湿转液：2.929g Glycine，5.814g Tris，0.375g SDS，加600ml ddH2O，搅拌溶解，待充分溶解后，加入200ml Methanol，摇匀并定容至1000ml，
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第2章材料与方法
4℃保存。

(9) 1×TTBS洗脱液：8.0g NaCl，2.4g Tris·HCl，加850ml 二蒸水搅拌溶解，再加入500μl Tween-20，摇匀，调pH值为7.5用量筒定容至1000ml，室温保存备用。

(10) 封闭液：①5%牛奶封闭液：5.0g脱脂奶粉+100ml 1×TTBS，摇匀，最好是10分钟以后再用，让牛奶充分溶解，4℃保存备用；②5%BSA封闭液：0.5g BSA 粉末+10ml 1×TTBS，摇匀，4℃保存备用。

2.3.4.2 H9c2细胞蛋白提取
总蛋白的提取
(1) 提取总蛋白前，按照100:1:1(RIPA基础裂解液: PMSF: Cocktail)的比例配制适量总蛋白提取液(lysing buffer)，混匀，冰上预冷；
(2) 实验各组处理结束后，用预冷的1×PBS缓冲液轻柔漂洗2-3遍，用枪吸干净PBS缓冲液；
(3) 每个培养皿(10cm)加250-300μl预冷的蛋白提取液，轻摇使蛋白提取液覆盖培养皿中细胞，冰上孵育15min；
(4) 用细胞刮刮下细胞，分组收集细胞提取液至预冷的EP管中，4℃旋转15min，使细胞充分裂解；
(5) 离心，4℃，12000rpm，15min；
(6)吸取上清液，移至预冷EP管，-20℃或-80℃（时间较久后才用）保存。

以上提取的H9c2细胞蛋白样品均可用BCA法测定蛋白浓度。

2.3.4.3 用BCA法测定蛋白浓度
(1) 配置BCA工作液：把试剂A和试剂B混合，试剂A：试剂B=50:1，备用。

(2) 稀释标准品：用二蒸水将蛋白标准品稀释至其母液浓度为0.5mg/ml；稀释后的标准品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl加入96孔板中，并用二蒸水补足体积至20μl。

(3) 加入4μl样品到96孔板中，再用二蒸水补足至总体积为20μl。

(4) 每孔加入200μl BCA工作液，混匀后，轻置于37℃恒温箱中孵育30min。

(5) 把96孔板放入已预热好的酶标仪中，在562nm波长处测定吸光度值，根据不同浓度蛋白标准品吸光度值，按样品顺序绘制标准曲线，根据公式计算各个蛋白样品的浓度。

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第2章材料与方法
2.3.4.4蛋白质免疫印迹(Western Blotting)法的实验操作
用二蒸水清洗Bio-Rad垂直电泳仪装置，晾干，可用滤纸在边缘吸干，按照以下步骤进行操作
(1)聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制
用二蒸水清洗配胶用的1.5cm玻璃板，安装好配胶装置，验漏合格后（验漏5min），按照配方配分离胶。

表一：8%、12% 和15%SDS-PAGE分离胶的配方(10ml体系)
试剂(ml) 8% 12% 15% 30%聚丙烯酰胺 2.7 4.0 5.0 Tris·HCl(pH 8.8) 2.5 2.5 2.5
三蒸水 4.6 3.3 2.3
10%SDS 0.1 0.1 0.1
10%过硫酸胺0.1 0.1 0.1 TEMED 0.004 0.004 0.004
a. 按表一加入试剂，混匀后快速用大枪灌入配胶装置，灌胶高度为玻璃板2/3左右，用1ml异丙醇将胶与空气隔绝，37℃放置60min以上，待分离胶凝固好后，按表二配方配聚成胶；
b. 弃去分离胶上的异丙醇，用三蒸水清洗2次，去除胶面残留的有机溶剂，用滤纸吸干三蒸水，按表二配制聚成胶，混匀，灌胶，并立即插入配套的梳子，防止聚成胶凝固，室温或37℃放置40min以上，聚成胶完全凝固后电泳，也可4℃冰箱保存备用。

表二：5% SDS-PAGE聚成胶的配方(10ml体系)
试剂(ml) 5%聚成胶
30%聚丙烯酰胺 1.7
Tris·HCl(pH 6.8) 1.3
三蒸水 6.8
10%SDS 0.1
10%过硫酸胺0.1
TEMED 0.01
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第2章材料与方法
(2)电泳
①样品的制备：用BCA法测定蛋白浓度并标化样品，使每组蛋白总量相同，按3:1(蛋白: 4×蛋白上样缓冲液)比例配制并混匀样品，沸水浴8-10min，样品冷却后上样。

②蛋白质电泳：聚成胶：电压90V，时间30-40min；溴酚蓝移至分离胶和聚成胶界面并压成一条直线时，换电压为120V，时间70-90min，可酌情增加时间，待溴酚蓝移至胶底部1.5-2cm时，结束电泳，剥胶备用。

(3)转膜
①切胶：根据Mark所标记的分子量，把目的蛋白条带切下，位置尽量略宽于目的蛋白条带，用镊子轻轻把凝胶放入湿转液中备用。

②剪膜：剪下与需要转膜凝胶相同大小的PVDF膜，用甲醇浸泡1-2min，激活，剪下比海绵垫稍小的6张滤纸，上下各三张，长度与宽度应大于凝胶长度与宽度，滤纸放湿转液中浸泡，备用；
③湿转：按“电转三明治”法，在湿转夹黑面(负极)依次叠放海绵垫、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸和海绵垫，各层之间避免有气泡，白面(正极)覆盖夹紧，放入湿转装置，接通电源，根据各目的蛋白的分子量选择不同转膜条件。

本实验目的蛋白的分子量和转膜条件如下：p-Akt/Akt (60KDa；90mA，80min)、p-GSK3β/GSK3β(46KDa；90mA，70min)VDAC1 (34KDa；90mA，70min)、p-VDAC1 (34KDa；300mA，180min)、HK2 (102KDa；200mA，100min)、Bax (23KDa；60V，50min) 和β-actin (42KDa；90mA，80min)。

(4) 封闭：湿转完后，将PVDF膜放入5%牛奶或5%BSA封闭液中，室温缓慢平摇1-2h。

(5) 孵育一抗：将PVDF膜浸入按比例稀释好的一抗，稀释液为封闭液，4℃反应8h以上，一抗中含0.02%叠氮钠可延长使用次数和时间。

(6) 孵育二抗：1×TTBS洗膜：12min×3次，将膜浸入用牛奶配制的二抗反应液(二抗: 封闭液=1: 4000)中，摇床缓慢摇1h。

(7) 检测：1×TTBS洗膜：10min×6次；ECL显色：取ECL发光液A和B各200μl，膜浸没在混匀的发光液中反应1-2min，上下轻轻翻动，用滤纸吸去膜边缘的发光液，放入密封袋中，赶出气泡；①暗房中曝光：压片，曝光10s-15min，显影，
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第2章材料与方法
定影，清洗胶片，晾干，做好标记。

②用Tanon5200化学发光成像系统曝光，曝光5s-300s，图片做好标记，存入文件夹中保存。

2.3.4.5 半定量分析
用Tanon5200化学发光成像系统或用扫描仪扫描胶片并整理好图片进行半定量分析，运用ImageJ软件对图片条带进行灰度值分析，用目的蛋白条带和内参条带的综合密度值相比，所得结果即为所需结果。

2.3.5免疫沉淀(Immunoprecipitation)法和免疫共沉淀
(Co-Immunoprecipitation)检测H9c2心肌细胞中VDAC1蛋白磷酸化水平以及与HK2、Bax蛋白结合程度。

2.3.5.1 免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co- IP)法的原理
免疫沉淀法用来分离某个细胞萃取物中的已知特定蛋白质，免疫共沉淀是以抗原蛋白质和抗体能特异性结合为基础，而细菌蛋白质的“Protein A/G”可以特异性结合到抗体的Fc片段，以此原理开发出来提纯蛋白质和验证蛋白质相互作用的方法。

2.3.5.2 免疫沉淀法和免疫共沉淀法检测步骤
两者检测步骤基本一致，H9c2心肌细胞总蛋白提取方法和论文2.3.4.2-A相同；提取蛋白后，用BCA法测定蛋白浓度，实验各组取适量蛋白用于Western Blotting分析，适量蛋白进行免疫沉淀检测。

具体步骤如下：
(1) 实验各组取相同蛋白量(体积约为100μl)置于预冷的1.5ml EP管中，加入1μl Anti-Phosphoserine或HK2或Bax抗体，4℃，旋转孵育8-12h。

(2) 准备Protein G Plus/Protein A Agarose Suspension：
每个预冷的1.5ml EP管中加入20μl Protein G Plus/Protein A Agarose Suspension (用枪头吸取Protein G时，剪去枪尖部分，以免破坏Protein G Plus/Protein A Agarose Suspension)，共4组，用预冷1×PBS缓冲液轻柔洗涤Protein G Plus/Protein A Agarose Suspension，500μl，4℃，2500rpm，离心5min，用枪头吸去上清液，重复三次。

(3) 将已加抗体孵育过夜的蛋白移至装有Protein G Plus/Protein A Agarose Suspension的EP管中，4℃，旋转，继续孵育5h，使抗体与Protein G Plus/Protein
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