浊度对荧光光谱法测定水体中叶绿素a的影响

浊度对荧光光谱法测定水体中叶绿素a的影响
吕鹏翼;崔建升;段莉丽
【摘要】研究了浊度对荧光光谱法测定水体中叶绿素a的影响.采用荧光分光光度计分别测定了不同浊度的叶绿素a提取液和铜绿微囊藻液的荧光强度,使用海水叶
绿素现场检测仪测定了不同浊度的铜绿微囊藻液和实际水样的叶绿素a浓度值.结
果表明:当水体浊度较大时,由于悬浮颗粒物的强烈散射作用会使叶绿素a的测定结果偏高.当水体透明度较高时,浊度对测定的影响基本可以忽略.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2015(051)006
【总页数】4页(P741-744)
【关键词】荧光光谱法;叶绿素a;浊度;水
【作者】吕鹏翼;崔建升;段莉丽
【作者单位】河北科技大学环境科学与工程学院河北省污染防治生物技术实验室,
石家庄050000;河北科技大学环境科学与工程学院河北省污染防治生物技术实验室,石家庄050000;河北科技大学环境科学与工程学院河北省污染防治生物技术实
验室,石家庄050000
【正文语种】中文
【中图分类】O657.31
荧光光谱法与传统的分光光度法[1]和高效液相色谱法(HPLC)[2]相比,具有灵敏度高、操作简便、无需提取、可现场实时测定的特点[3],已成为测定水体中叶绿素a的主
要方法。

文献[4]利用叶绿素a在一定浓度范围内与其荧光强度之间具有良好的线性关系,建立了实验室荧光分光光度法直接测定水体中叶绿素a。

利用荧光光谱法连续测定活体内叶绿素含量的方法最早于1966年由Lorenzen[5]提出,经过几十年的发展,现场荧光光谱法测定叶绿素a已较成熟。

但由于自然水体的复杂性,环境因素可能会对测定结果产生一定的影响[6]。

浊度反映了水中悬浮物对光线透过时所产生的阻碍程度,会影响光在水体中的透射深度和路径。

一般水体悬浮颗粒物主要包括微型生物残体以及泥沙等无机颗粒物,悬浮在水中的这些物质或者微粒不具有荧光性,但是它们会使光线发生反射或者折射现象。

叶绿素在线测定仪的检测环境是实际水体,测定结果不可避免地会受浊度的影响。

文献[7-8]报道当水体较浑浊时,会使叶绿素a的荧光测定结果偏高。

在使用荧光探针测定水体中的叶绿素a含量时发现,水体中的悬浮颗粒会对测定结果产生一定影响[9]。

本工作分别研究了浊度对荧光光谱法测定叶绿素a提取液、铜绿微囊藻液和实际水样的影响,旨在分析浊度对荧光光谱法测定浮游植物中叶绿素a含量的影响机理和影响程度,提高海水中叶绿素现场检测数据的精确度。

1．1 仪器与试剂
722型可见分光光度计;UV-2600型紫外-可见分光光度计;岛津RF 5301型荧光分光光度计;XHCHL-90A型海水叶绿素现场检测仪。

无浊度水:将蒸馏水通过0.2 μm滤膜制备。

浊度标准溶液:400 NTU,用10 g·L-1硫酸肼溶液、100 g·L-1六次甲基四胺溶液和无浊度水参照国家标准GB 13200-91[10]配制。

叶绿素a标准储备溶液:10.0 mg·L-1。

1．2 仪器工作条件
1) 荧光分光光度条件激发波长为436.0 nm,发射波长为672.0 nm;激发和发射
通带宽度均为5.0 nm。

2) 海水叶绿素现场检测条件测量模式为“连续测量”;测量间隔设为30 s;每个样品连续测量15 min,取其平均值。

3) 紫外-可见分光光度条件可见分光光度计,测定波长为680 nm。

1．3 试验方法
1．3．1 绘制浊度标准曲线
将浊度为400 NTU的标准溶液逐级稀释后,配成浊度为0,4,10,20,40,80,100 NTU 的标准溶液,于波长680 nm处,用30 mm比色皿测量吸光度,绘制浊度标准曲线。

所得线性回归方程为y=0.003 6 x+0.002 4,相关系数为0.999 9,浊度标准样品在680 nm处的吸光度与浊度值呈线性关系。

得到的标准曲线可以用于测定样品浊度。

1．3．2 样品的制备
取对数生长期的铜绿微囊藻参照《淡水浮游生物研究方法》[11]提取叶绿素a,用乙醇(9+1)溶液定容至100 mL,作为叶绿素a的标准储备溶液,用分光光度法测定其质量浓度为10.0 mg·L-1。

取对数生长期的铜绿微囊藻用灭菌的蒸馏水稀释1～20倍,制备铜绿微囊藻液样品
系列。

1．3．3 浊度对荧光光谱法测定叶绿素a的影响
分别配制相同浓度、不同浊度的叶绿素a溶液标准系列和铜绿微囊藻液样品系列,
采用荧光分光光度计和海水叶绿素现场检测仪分别测定样品的荧光强度。

2．1 铜绿微囊藻液标准曲线的建立
使用紫外-可见分光光度计于室温下测量了铜绿微囊藻液在波长370～710 nm范
围内的吸光度,确定了铜绿微囊藻液的特征吸收波长为680 nm。

用可见分光光度
计于波长680 nm处测量20个铜绿微囊藻液样品系列的吸光度;并使用荧光分光
光度计测定20个样品的荧光强度。

绘制样品在波长680 nm处的吸光度与荧光强
度的关系曲线,确定荧光光谱法测定铜绿微囊藻液对应的吸光度范围。

铜绿微囊藻稀释液在波长680 nm处的吸光度与其对应的荧光强度的关系曲线,见
图1。

由图1可知:吸光度在0.175～0.460范围内时,荧光强度呈线性上升趋势;当吸光度
为0.460左右时,荧光强度出现拐点呈缓慢上升趋势;当吸光度大于1.0时,荧光强度呈下降趋势,这是因为发生了荧光猝灭,当溶液浓度过大时,荧光强度反而会大大低于接近饱和状态时的荧光强度。

吸光度在0.175～0.460范围内与荧光强度呈线性关系,线性回归方程为y=28.08
x+2.557,相关系数为0.997 7。

试验选择荧光分光光度法测定铜绿微囊藻液对应的吸光度范围为0.175～0.460,对应的荧光强度范围为7.3～15.3。

2．2 浊度标准溶液的荧光特性试验
取浊度为400 NTU的标准溶液,用无浊度水配制不同浊度的样品溶液,分别以无浊
度水和乙醇(9+1)溶液为空白参比,用荧光分光光度计进行测定。

结果表明:以乙醇(9+1)溶液为溶剂配制不同浊度的样品溶液,以无浊度水或以乙醇(9+1)溶液为空白
参比,荧光强度均随浊度的增大呈上升趋势。

已知浊度溶液为无机悬浮物质不具有
荧光特性,因而判断所测得的荧光强度主要是由浊度溶液对激发光的散射产生的,且
两者呈良好的正线性相关,即在一定浊度范围内,水体中悬浮物质的散射光强度与浊
度呈线性关系。

以无浊度水和以乙醇(9+1)溶液为空白的线性回归方程分别为
y=0.010 2 x+0.043 66,y=0.011 1 x+0.055 6,相关系数分别为0.998 6,0.998 9。

以无浊度水为空白测得的荧光强度普遍高于以乙醇(9+1)溶液为空白测得的荧光强度,这是因为浊度溶液为无机物不溶于乙醇而溶于水所致。

2．3 浊度对荧光光谱法测定叶绿素a提取液的影响
移取叶绿素a标准储备溶液加入不同量的浊度标准溶液,配制质量浓度为0.5 mg·L-1的不同浊度的叶绿素a溶液样品系列。

以无浊度水为空白参比,测定样品的
荧光强度。

以浊度为横坐标,荧光强度为纵坐标绘制曲线,结果见图2。

由图2可知:浊度在10～90 NTU范围内,相同含量的叶绿素a溶液随浊度的升高荧光强度呈上升趋势。

浊度约为10 NTU的样品未加浊度标准溶液,其浊度主要是由样品本身贡献;浊度约为90 NTU时的样品的荧光强度中浊度标准溶液的贡献约为10.68%。

测定结果偏高主要是由于样品中悬浮的颗粒物使激发光源产生的激发光或叶绿素a产生的荧光发生了散射,即荧光强度增大主要是由浊度溶液中无机悬浮物粒子发生散射作用的贡献。

2．4 浊度对荧光光谱法测定铜绿微囊藻液的影响
取对数生长期的铜绿微囊藻液按2.1节稀释至荧光光谱法可测范围内,加入不同量的浊度标准溶液配制不同浊度的样品系列。

以无浊度水为空白参比测定样品的荧光强度。

以浊度为横坐标,荧光强度为纵坐标绘制曲线。

结果表明:浊度在55.72～126.78 NTU范围内,随着浊度的增大荧光强度呈上升趋势,且两者呈正线性相关,线性回归方程为y=0.031 9 x+1.813 2,相关系数为0.998 7。

浊度增大,铜绿微囊藻液的荧光强度增大,是由浊度溶液中的无机悬浮粒子发生了散射。

2．5 浊度对海水叶绿素现场检测仪测定铜绿微囊藻液的影响
移取对数生长期的铜绿微囊藻液100 mL,用灭菌的蒸馏水定容至500 mL,作为储备溶液;依次移取50.00 mL储备溶液加入不同量的浊度标准溶液用灭菌蒸馏水定容至1 L,配制8个不同浊度值的样品;用海水叶绿素现场检测仪依次进行测定,同时测量其在波长680 nm处的吸光度,并求其浊度,结果见表1。

其中相对误差指海水叶绿素现场检测结果与认定值的相对误差。

由表1结果可知:浊度在30.17～62.39 NTU范围内,随浊度的增大,海水叶绿素现场检测仪的测定结果呈缓慢上升趋势,这与实验室荧光光谱法浊度试验得出的结论一致。

以未加浊度液的样品1的测定结果为认定值,样品的测定值与认定值的相对误差在1.5%～12%范围内,所以浊度在30.17～62.39 NTU范围内时,浊度对海水叶
绿素现场检测仪测定叶绿素a的影响在可接受范围内。

2．6 样品分析
选取不同区域浊度不同的水样20个,移取300 mL水样用分光光度法测定水体中叶绿素a的含量,同时测量其在680 nm处的吸光度,并求出其浊度;另一部分水样用海水叶绿素现场检测仪在自然条件下测定其中叶绿素a的含量,结果见表2。

其中相
对误差指分光光度法测定值与海水叶绿素现场检测仪测定值的相对误差。

由表2可知:随浊度的增大,分光光度法测定结果与检测仪测定结果的相对误差整体呈下降趋势,即海水叶绿素现场检测仪的测定值随浊度的增大,整体呈上升趋势,这与用海水叶绿素现场检测仪测定铜绿微囊藻液的浊度影响试验结果一致。

在现场测定环境中,当水样受到光照时,除荧光物质产生荧光外,无机悬浮颗粒物还会产生散射光。

由表2数据还可知:当水体浊度在47.8～91.4 NTU范围内时,浊度对检测仪的测定
结果影响较小,相对误差在13%～-9.8%范围内;当水体浊度在91.4～162.8 NTU
范围内时,相对误差在-9.8%～-20%范围内,浊度对检测仪的测定结果影响较大,可见当水体中含有大量悬浮物质或颗粒物时,由于强烈的散射作用,会提高测定的本底值,从而造成测定结果偏高。

在实际测量中,当所测水体浊度较大或对测定结果的准确
度要求较高时,在测定不同水域浮游植物的叶绿素a含量前,应先采用标准方法对海水叶绿素现场检测仪进行校准后再测定。

综合上述可知:利用分光光度法与荧光光谱法测定不同浓度铜绿微囊藻样品时,样品
的吸光度在0.175～0.460范围内与荧光强度呈良好的正相关,当吸光度大于1.0时,由于荧光猝灭,样品的荧光强度呈下降趋势。

利用荧光光谱法和海水叶绿素现场检
测仪分别对不同状态的叶绿素a样品进行浊度试验,结果表明:随浊度的增大,样品荧光强度总体呈上升趋势,主要是因为水体中所含的悬浮颗粒物使激发光或荧光物质
发射的荧光发生了散射,故当用叶绿素a现场检测仪测定水体中的叶绿素a时应注
意浊度的影响,当水体透明度较高时,浊度对测定的影响基本可以忽略。

Effect of Turbidity on Fluorescence Intensity of Chlorophyll-a in Water
LÜ Peng-yi, CUI Jian-sheng*, DUAN Li-li
(Pollution Prevention Biotechnology Laboratory of Hebei Province, School of Environmental Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050000, China)
Abstract：Effect of turbidity on the fluorescence intensity determination of chlorophyll-a in water was studied. Spectrofluorophotometer was used to measure the the fluorescence intensity of the solutionmicrocystis aeruginosa and the extract of chlorophylla with different turbidity. The concentration of chlorophyll-a in microcystis aeruginosa and water samples with different turbidity was determined using the on-line detector for chlorophyll in seawater. It was found that the measured concentration of chlorophyll-a was high due to the strong scattering effect of suspended particules when water turbidity was high. The effect of turbidity was negligble when the water was transparent.
Keywords：Spectrofluorophotometry; Chlorophyll-a; Turbidity; Water DOI：10.11973/lhjy-hx201506002
收稿日期：2014-05-21
基金项目：国家高技术产业化项目(2007AA092201)
作者简介：吕鹏翼(1987-),女,河北辛集人,硕士,主要从事环境监测生物传感器研究工作。

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中图分类号：O657.31
文献标志码：A
文章编号：1001-4020(2015)06-0741-04
由表2可知:随浊度的增大,分光光度法测定结果与检测仪测定结果的相对误差整体呈下降趋势,即海水叶绿素现场检测仪的测定值随浊度的增大,整体呈上升趋势,这与用海水叶绿素现场检测仪测定铜绿微囊藻液的浊度影响试验结果一致。

在现场测定环境中,当水样受到光照时,除荧光物质产生荧光外,无机悬浮颗粒物还会产生散射光。

由表2数据还可知:当水体浊度在47.8～91.4 NTU范围内时,浊度对检测仪的测定
结果影响较小,相对误差在13%～-9.8%范围内;当水体浊度在91.4～162.8 NTU
范围内时,相对误差在-9.8%～-20%范围内,浊度对检测仪的测定结果影响较大,可见当水体中含有大量悬浮物质或颗粒物时,由于强烈的散射作用,会提高测定的本底值,从而造成测定结果偏高。

在实际测量中,当所测水体浊度较大或对测定结果的准确
度要求较高时,在测定不同水域浮游植物的叶绿素a含量前,应先采用标准方法对海水叶绿素现场检测仪进行校准后再测定。

综合上述可知:利用分光光度法与荧光光谱法测定不同浓度铜绿微囊藻样品时,样品
的吸光度在0.175～0.460范围内与荧光强度呈良好的正相关,当吸光度大于1.0时,由于荧光猝灭,样品的荧光强度呈下降趋势。

利用荧光光谱法和海水叶绿素现场检
测仪分别对不同状态的叶绿素a样品进行浊度试验,结果表明:随浊度的增大,样品荧光强度总体呈上升趋势,主要是因为水体中所含的悬浮颗粒物使激发光或荧光物质
发射的荧光发生了散射,故当用叶绿素a现场检测仪测定水体中的叶绿素a时应注
意浊度的影响,当水体透明度较高时,浊度对测定的影响基本可以忽略。

* 联系人。

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【相关文献】
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