结核分枝杆菌双靶标环介导恒温扩增检测方法的建立与应用

物 浓 度 和 反 应 条 件 优 化 .建 立 基 于 双 靶 标 的 检 测 方 法 （mr/>40丄 A M P和 IS 6110-LAMP),比 较 2 种 方 法 的 灵 敏 度 和 特 异 性 。应 用 建 立 的 / " 0 4 O-LAM丨3 和 LS6110-LAMP方 法 与 PCR、萋 -尼 氏 抗 酸 染 色 法 和 分 枝 杆 菌 分 离 培 养 法 ，分 别 对 5 5 例 患 者 的 痰 标 本 进 行 检 测 与 鉴 定 . 通 过 对 其 结 果 的 比 较 分 析 评 价 /«?/>40-LAMP和 7S6110-LAMP方 法 的 实 用 性 。 结果
Q Q I Loop-mediated isothermal ampliiication；Mycobacterium tuberculosis c o m p le x ；Mycobacterium tuberculo­ s i s ；color determination
【基金项__目__】_ 贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑[2019]2822号 ，黔科合支撑[2018]2762号）；贵州省科技计划项目（黔科合基础[2019] 1 1 8 6 号 ）；贵 州 省 科 技 创 新 人 才 团 队 专 项 资 金 项 目 （黔 科 合 平 台 人 才 [2 0 1 8 ]5 6 0 6 > ;贵 州 省 高 层 次 创 新 型 人 才 培 养 项 目 （黔 科 合 [2 0 1 6 ]4 0 2 1) 。 【通讯作者】 李 世 军 ，E-m ail :zjum edjun@ 163. com 【作者简介】 杨幸贵（1997-) •男，贵州人，在读硕士研究生，主要从事结核分枝杆菌诊断及分子流行病学研究。E-mail: 1085750482@
【摘 要 】 目的 建 立 基 于 双 粑 标 环 介 导 恒 温 扩 增 （LAMP)的 结 核 分 枝 杆 菌 （MTB)检 测 技 术 并 应 用 于 临 床 。 方 法
以 结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群 （MTBC)插 人 序 列 LS6 1 1 0 和 MTBm0 4 O基 因 为 检 测 粑 标 ，分 别 设 计 1 套 LAMP引 物 。通过引
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中 国 病 原 生 物 学 杂 志 2021年 5 月 第 16卷 第 5 期 J o u r n a l o f P a th o g e n B io l o g y May 2021 • Vol. 16. No. 5
was exam ined» and the Kappa value was 0. 881 ( P <C0. 01). The Kappa value between m//)40-LAMP and T C H was
鉴 别 MTB。痰 标 本 检 测 显 示 ，/S 6110-LAMP与 PN B 鉴 定 结 果 一 致 性 检 验 的 Ka/j p u 值 为 0. 8 8 1 ( P < 0 . 01),m?/>40-
LAMP与 T C H 鉴 定 结 果 的 Ku/>如 值 为 0.887(P < 0 . 0 1 ) 。与 PCR 方 法 和 萋 - 尼 氏 抗 酸 染 色 法 检 测 结 果 比 较 . 加 MOLAMP 和 7S6110-LAMP 方 法 敏 感 性 更 高 。反应体系 屮加人 MG 指 示 剂 可 直 接 通 过 肉 眼 观 察 颜 色 变 化 进 行 结 果 判 定 ，
YANG Xing-gui1.2 ， H U A N G Jun-fei2 , C H E N Yi-jiang:>, XIAO Zi-y u 1'2 , W A NG Xiao-ju a n 1'2 , ZHEN G Wen-linL，, C H E N Xu:i . LIU Ying2 , C H E N Wei2 , YU A N Wei2 , H U Y ong1 , LI Shi-j u n 1'2
实 现 了 快 速 闭 管 检 测 。从 样 本 处 理 （35 min) 、扩 增 反 应 （40 min)到 结 果 验 证 （1〜2 min).整 个 检 测 过 程 80 m in内即可完 成 。 结 论 基 于 LAMP技 术 建 立 的 LAMP和 /S 6110-LAMP双 耙 标 检 测 方 法 敏 感 性 高 、特 异 性 强 ，能 够 快 速 、
^Journal o f Pathogen B io lo g y. 2021 M ay；1 6 (5 ) ：513 —5 1 9 .] Development and use of loop-mediated isothermal amplification (LAM P) based on 2 target genes for rapid detection ^ M ycobacterium tuberculosis
中 国 病 原 生 物 学 杂 志 2021年 5 月 第 16卷第5 期 J o u r n a l u j Pathofien B i o l o g y May 2021. Vol. 16. No. 5
D()I ：10. 1 3 3 5 0 / j . cjpb. 2 1 0 5 0 4
•论著•
80 min. Conclusion The established methods of m?/>4〇-LAMP and /S 6 1 1 0 - L A M P , as sensitive and specific techniques
based on 2 target genes, were able to detect MTB quickly and accurately and could be used as a potential screening and di­ agnostic tool for MTB.
[Abstract] Objective To establish loop-mediated isotherm al amplification (LA M P) based on 2 target genes for detec­ tion of Mycobacterium tuberculosis ( M TB) and use it in clinical practice. Methods T w o sets of L A M P p rim ers, re­ spectively targeting the insertion sequence (7S6110) of the MTB complex (M TBC) and the mtpAO gene of M TB, were designed. Methods based on the 2 target genes (w//>40-LAMP and /S6110-LA M P) were established after optimizing the primer concentrations and reaction conditions» and their sensitivity and specificity were evaluated. Fifty-five sputum sam ­ ples from patients were te ste d , and M TB was differentiated using w /p 4 〇-L A M P , /S 6 1 1 0 -L A M P , P C R , Ziehl-Neelsen staining, and mycobacterial culture. Results were analyzed to evaluate the practicality of both w//>40-LAM P and /S6110LA MF3. Results Sensitivity tests indicated that the limit of detection (L oD ) was 125 fg //il of M TB genomic DNA for /?7；/)40-L A M P and /S 6 1 1 0 -L A M P , which was 10-100-fold higher than that of conventional PCR. m //)40-L A M P and /S6110-LA M P have excellent specificity (100% ). The two established methods were able to detect M TB strains and to differentiate M TB from MTBC. T he consistency with which /S 6 1 1 0 -L A M P and PNB detected M TB in sputum sam ples
(1. Public Health School ^Guizhou Medical University ^Guiyang 550025 ^China ；2. Guizhou Center f o r Disease Control and Prevention ；3. The Second A ffilia te d Hospital A ffilia te d -with Guizhou University o f T radition al Chinese M e d i­ cine )
准 确 地 检 测 和 鉴 别 MTB.可 作 为 潜 在 的 MTB快 速 筛 査 或 诊 断 工 具 。
【关 键 词 】 环 介 导 恒 温 扩 增 ；结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群 ；结 核 分 枝 杆 菌 ；Βιβλιοθήκη 色判定【中 图 分 类 号 】
【文 献 标 识 码 】
【文 章 编 号 】 1673-5234(2021)05-0513-07
0. 887(P<C0. 01). tom；/)4〇-L A M P and /S 6 1 1 0-L A M P had a higher sensitivity than PCR and Ziehl-Neelsen staining. Re­
sults could be directly determined by observing the color change with the naked eye when the MG indicator was added to the mixture. Rapid closed-tube detection of MTB was achieved. In addition, the whole procedure, including sample pro­ cessing (35 m in ), isothermal amplification (40 m in ), and confirmation of results (1-2 m in ), could be completed within
结核分枝杆菌双靶标环介导恒温扩增检测方法的
建立与应用>
杨 幸 贵 u ，黄 俊 飞 、 陈 依 江 、 肖 子 宇 u:_ , 汪 小 娟 u ，郑 雯 琳 、 陈 旭 3 , 刘 英 :>, 陈 玮 2, 袁 薇 ^ 胡 勇 、 李 世 军 w
(1 • 贵 州 医 科 大 学 公 共 卫生 学 院 ，贵 州 贵 阳 550025; 2 . 贵 州 省 疾 病 预 防 控 制 中 心 实 验 中 心 ； 3 .贵州中医药大学第二附属医院中心实验室）
灵 敏 度 试 验 显 示 ，m//)40-LAM P和 7S 6110-LAMP方 法 可 检 出 MTB基 因 组 DNA最 低 浓 度 为 125 fg/ ^ U 比 常 规 的
PCR方 法 髙 10〜1 0 0 倍 。
和 /S6110-LAMP方 法 的 特 异 性 为 1 0 0 % , 能 检 测 MTB菌 株 并 能 从 MTBC中