慢性氟中毒大鼠脊髓神经细胞的凋亡及其发生机制研究
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对 此进 行 了探 索 。
１ 材料和 方 法
蛋白条带作为内参 ， 计算 ｃ ｌ － ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ 一 ９和 ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ 一 ３ 蛋白条带与内参蛋 白条带总灰度 的百分 比， 作 为凋亡 蛋白表达的相对水平 ， 与对照组相 比， ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ 一 ３及 ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ ９的表 达水 平均增 加 （ Ｐ＜ Ｏ ． ０ ５ ） ， 随染 氟浓 度 增高 ， 凋亡蛋 白酶表达有 增加趋势 ， ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ ９ 表 达
潘双 杰 ， 何远 宏 ， 王楠 ， 郝 东杰
郑州大学第五 附属 医院神 经内科 ， 河南 ４ ５ ０ ０ ５ ２ 中图分类号 ： Ｒ ５ ９ ９ ． １ 文献标识码 ： Ｂ 文章 编号 ： １ ０ ０ １ — １ ８ ８ ９ （ ２ ０ １ ６ ） １ 卜１ ２ ３ ３ — ０ １
１ ． ８ ＋ － ０ ． ７ 。 ３ ． ２ ± １ ． ４ 曲 ５ ． ３ ￣ ２ ． １
晚期凋亡率 （ ％） １ ． ６ ￣ ０ ． ８ ２ ． ３ － ＋ １ ． １
注： 与对照组 比较 ， ａ Ｐ ＜ Ｏ ． ０ ５ ； 与低 氟组 比较 ， ｂ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ； 与中氟组 比
２ 结 果
３ 讨
论
本研 究 的优 势在 于根 据 大 鼠 Ｌ Ｄ ５ ０设 计 不 同梯 度 浓度 的氟化水 染毒 ６个 月 ， 减 少 了急 性 中毒 及染 毒 时
间过 短 出现 的偏倚 ； Ａ ｎ ｎ ｅ ｘ ｉ ｎ Ｖ－ Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ ／ Ｐ Ｉ 双 标 记试 剂 盒
２ ． １ 尿氟、 血氟含量 染氟 ３ 、 ６ 个月时中氟组与高氟 组无 差异 （ － １ ． ８ ９ ， 一 ０ ． ６ ８ ； Ｐ＝ ０ ． ０ ６， ０ ． ４ ９ ９ ） ， 余 各 组
较ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ ３表达少 。
表 １ 各 剂量 组尿氟和血氟浓度 ［ （ ｘ － ， － ｓ ） ｍ ｇ ／ Ｌ ］
１ ． １ 动物 分 组及 处理
浙 江 大 学 医 学 院动 物 中心 提
供 初 断乳 Ｓ Ｄ大 鼠 １ ２ ０只 ， 雌雄 各半 ， 驯养 １周后 ， 随机 分 为对 照组 和低 、 中、 高 氟组 ， 每组 ３ ０只 ， 雌 雄 分 笼 饲 养， 各剂 量 组 饮 水 氟 化 钠 浓 度 分 别 为 ０ 、 ２ ５ 、 ５ ０ 、 １ ０ ０ ｍ ｇ ／ Ｌ， 饲料 由动 物 中心 统 一 提 供 （ 含氟量 ＜ １ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ ） 。 分别 于 ３ 、 ６月 时使 用代 谢笼 收集 ２ ４ ｈ尿液 。 １ ． ２ 方法 根 据三 度 法 观 察 大 鼠 ３ 、 ６个 月 时 氟斑 牙 的发 生情 况 。４组大 鼠均 于 ２ ４周 时取 胸 段脊 髓 切 片 ， 脱水 ， 石 蜡包 埋 ， 横 断 面切 片 （ ５ ｍ） ， 每 组 每只 动 物取 切片 ３张 。 部 分 脊 髓 组 织 在 干净 的 培 养 皿 上 剪 成 泥 状， 用Ｐ Ｂ Ｓ反 复 冲 洗 后 ， 用 一 次 性 吸管 将 组 织 一 起 吸 出， 用３ ０ ０目过滤 膜过 滤 ， 制成 单细 胞悬 液 ， １ ０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ／ ｍｉ ｎ离心 ５ ｍｉ ｎ后弃 上 清 ， 沉 淀用 振荡 器轻 微振 荡后 以
不 同时 间点尿 氟及 血 氟 比较 均有 差异 （ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 见 表
１。
检测 凋亡 细胞 ， 将 坏死细 胞 、 机械损 伤细 胞与 凋亡 细胞 区分 开 ， 使 得凋 亡 检测 更 准 确 。不 足 之 处 在 于 由于 脊
髓 细长 ， 不 易分 离 ， 流式 细 胞 分 析 样 品量 不 足 ， 未 能 检
较， ｃ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ 。
２ ． ４ 细胞凋亡 随染氟剂量增加 ， 脊髓神经细胞凋亡 百分 比逐 渐升 高 ， 各 剂 量 组之 间差 异 均 有 统计 学 意 义
（ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 见表 ２ 。
低氟组
中氟组
３ ． ８ ＋ ０ ． ７
高氟组
４ ． ３ －１ ＋ ． ６ 曲
备用。蛋 白印 记 法 （ ｗ ｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ ） 检测 ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ 一３ 、
表 ２ 各剂量组细胞凋亡百分 比（Ｘ 一 ＋ － Ｓ ， ｎ ＝ ３ ０ ）
对照组
早期凋亡率 （ ％） ０ ． ９ ＋ ０ ． ６
注： 与对照组 比较 ， ａ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ； 与低氟组 比较 ， ｂ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ； 与 中氟组 比
中国地方病防治杂志
２ ０ １ ６年 １ ２月第 ３ １卷第 １ １ 期
Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｃ ｔ ｒ ｌ Ｅ ｎ ｄ ｅ ｍ Ｄｉ ｓ Ｖｏ １ ． ３ １ Ｎ ｏ ． １ １ ２ ０ １ ６
慢 性 氟 中毒 大 鼠脊 髓 神 经 细胞 的凋 亡 及 其 发 生 机 制研 究
Hale Waihona Puke 氟作为一种细胞毒性物质 ， 具有超强的诱导脂质 过氧化作用 ， 导致体内 自由基 蓄积 ， 若不 能及时清除 ， 引起一系列连锁反应 ， 最终发生细胞凋亡或坏死。脊 髓神经作为神经系统的一部分 ， 氟也可对其造成损伤 ， 氟 诱 导脊髓 神 经细胞 凋 亡 的机制 尚不 明确 ， 因此 ， 本 文
较， ｃ Ｐ＜ Ｏ ． ０ ５ 。
ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ － ９ 。流 式细 胞仪 检测 凋 亡细胞 。 １ ． ３ 统 计 学分 析 数 据 用 （ ｘ ＿ ｓ ） 表示 ， 用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ７ ． ０ 统计 软 件进 行方 差 分析 和 ｔ 检验 ， 检验 水准 仅＝ ０ ． ０ ５ 。
１ 材料和 方 法
蛋白条带作为内参 ， 计算 ｃ ｌ － ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ 一 ９和 ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ 一 ３ 蛋白条带与内参蛋 白条带总灰度 的百分 比， 作 为凋亡 蛋白表达的相对水平 ， 与对照组相 比， ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ 一 ３及 ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ ９的表 达水 平均增 加 （ Ｐ＜ Ｏ ． ０ ５ ） ， 随染 氟浓 度 增高 ， 凋亡蛋 白酶表达有 增加趋势 ， ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ ９ 表 达
潘双 杰 ， 何远 宏 ， 王楠 ， 郝 东杰
郑州大学第五 附属 医院神 经内科 ， 河南 ４ ５ ０ ０ ５ ２ 中图分类号 ： Ｒ ５ ９ ９ ． １ 文献标识码 ： Ｂ 文章 编号 ： １ ０ ０ １ — １ ８ ８ ９ （ ２ ０ １ ６ ） １ 卜１ ２ ３ ３ — ０ １
１ ． ８ ＋ － ０ ． ７ 。 ３ ． ２ ± １ ． ４ 曲 ５ ． ３ ￣ ２ ． １
晚期凋亡率 （ ％） １ ． ６ ￣ ０ ． ８ ２ ． ３ － ＋ １ ． １
注： 与对照组 比较 ， ａ Ｐ ＜ Ｏ ． ０ ５ ； 与低 氟组 比较 ， ｂ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ； 与中氟组 比
２ 结 果
３ 讨
论
本研 究 的优 势在 于根 据 大 鼠 Ｌ Ｄ ５ ０设 计 不 同梯 度 浓度 的氟化水 染毒 ６个 月 ， 减 少 了急 性 中毒 及染 毒 时
间过 短 出现 的偏倚 ； Ａ ｎ ｎ ｅ ｘ ｉ ｎ Ｖ－ Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ ／ Ｐ Ｉ 双 标 记试 剂 盒
２ ． １ 尿氟、 血氟含量 染氟 ３ 、 ６ 个月时中氟组与高氟 组无 差异 （ － １ ． ８ ９ ， 一 ０ ． ６ ８ ； Ｐ＝ ０ ． ０ ６， ０ ． ４ ９ ９ ） ， 余 各 组
较ｃ ｌ — ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ ３表达少 。
表 １ 各 剂量 组尿氟和血氟浓度 ［ （ ｘ － ， － ｓ ） ｍ ｇ ／ Ｌ ］
１ ． １ 动物 分 组及 处理
浙 江 大 学 医 学 院动 物 中心 提
供 初 断乳 Ｓ Ｄ大 鼠 １ ２ ０只 ， 雌雄 各半 ， 驯养 １周后 ， 随机 分 为对 照组 和低 、 中、 高 氟组 ， 每组 ３ ０只 ， 雌 雄 分 笼 饲 养， 各剂 量 组 饮 水 氟 化 钠 浓 度 分 别 为 ０ 、 ２ ５ 、 ５ ０ 、 １ ０ ０ ｍ ｇ ／ Ｌ， 饲料 由动 物 中心 统 一 提 供 （ 含氟量 ＜ １ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ ） 。 分别 于 ３ 、 ６月 时使 用代 谢笼 收集 ２ ４ ｈ尿液 。 １ ． ２ 方法 根 据三 度 法 观 察 大 鼠 ３ 、 ６个 月 时 氟斑 牙 的发 生情 况 。４组大 鼠均 于 ２ ４周 时取 胸 段脊 髓 切 片 ， 脱水 ， 石 蜡包 埋 ， 横 断 面切 片 （ ５ ｍ） ， 每 组 每只 动 物取 切片 ３张 。 部 分 脊 髓 组 织 在 干净 的 培 养 皿 上 剪 成 泥 状， 用Ｐ Ｂ Ｓ反 复 冲 洗 后 ， 用 一 次 性 吸管 将 组 织 一 起 吸 出， 用３ ０ ０目过滤 膜过 滤 ， 制成 单细 胞悬 液 ， １ ０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ／ ｍｉ ｎ离心 ５ ｍｉ ｎ后弃 上 清 ， 沉 淀用 振荡 器轻 微振 荡后 以
不 同时 间点尿 氟及 血 氟 比较 均有 差异 （ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 见 表
１。
检测 凋亡 细胞 ， 将 坏死细 胞 、 机械损 伤细 胞与 凋亡 细胞 区分 开 ， 使 得凋 亡 检测 更 准 确 。不 足 之 处 在 于 由于 脊
髓 细长 ， 不 易分 离 ， 流式 细 胞 分 析 样 品量 不 足 ， 未 能 检
较， ｃ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ 。
２ ． ４ 细胞凋亡 随染氟剂量增加 ， 脊髓神经细胞凋亡 百分 比逐 渐升 高 ， 各 剂 量 组之 间差 异 均 有 统计 学 意 义
（ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 见表 ２ 。
低氟组
中氟组
３ ． ８ ＋ ０ ． ７
高氟组
４ ． ３ －１ ＋ ． ６ 曲
备用。蛋 白印 记 法 （ ｗ ｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ ） 检测 ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ 一３ 、
表 ２ 各剂量组细胞凋亡百分 比（Ｘ 一 ＋ － Ｓ ， ｎ ＝ ３ ０ ）
对照组
早期凋亡率 （ ％） ０ ． ９ ＋ ０ ． ６
注： 与对照组 比较 ， ａ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ； 与低氟组 比较 ， ｂ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ； 与 中氟组 比
中国地方病防治杂志
２ ０ １ ６年 １ ２月第 ３ １卷第 １ １ 期
Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｃ ｔ ｒ ｌ Ｅ ｎ ｄ ｅ ｍ Ｄｉ ｓ Ｖｏ １ ． ３ １ Ｎ ｏ ． １ １ ２ ０ １ ６
慢 性 氟 中毒 大 鼠脊 髓 神 经 细胞 的凋 亡 及 其 发 生 机 制研 究
Hale Waihona Puke 氟作为一种细胞毒性物质 ， 具有超强的诱导脂质 过氧化作用 ， 导致体内 自由基 蓄积 ， 若不 能及时清除 ， 引起一系列连锁反应 ， 最终发生细胞凋亡或坏死。脊 髓神经作为神经系统的一部分 ， 氟也可对其造成损伤 ， 氟 诱 导脊髓 神 经细胞 凋 亡 的机制 尚不 明确 ， 因此 ， 本 文
较， ｃ Ｐ＜ Ｏ ． ０ ５ 。
ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ － ９ 。流 式细 胞仪 检测 凋 亡细胞 。 １ ． ３ 统 计 学分 析 数 据 用 （ ｘ ＿ ｓ ） 表示 ， 用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ７ ． ０ 统计 软 件进 行方 差 分析 和 ｔ 检验 ， 检验 水准 仅＝ ０ ． ０ ５ 。