引物设计

引物设计的原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚 体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

一般原则
1.引物长度： 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是1824 bp，但不应大于38bp，引物过短又同时 会引起错配现象，一般来说引物长度大于 16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因 组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在 人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp)，一般是用来区分 同源性较高的模板序列或者使用于产生一 些突变位点
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结 构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 But …
引物编辑
引物编辑
Edit primer here
Analysis the edit result

Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA基序(motif)查找 4、同源性分析
Primer Premier 5.0使用介绍(1) Load sequence
Preimer Premier 启动界面
基本信息
Sequence name Original sequence
Accept the edit result Return to the main window
Some other useful function of PP5
Enzyme
Melting temperature graph
Per 25-mer
GC% graph
Per 25-mer
Stability
PCR引物设计及相关软件使 用
PCR引物设计

引物设计是PCR 技术中至关重要的一 环。使用不合适的PCR 引物容易导致 实验失败：表现为扩增出目的带之外 的多条带（如形成引物二聚体带）， 不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。 可以直接提交模板序列到特定网页， 得到设计好的引物，也可以在本地计 算机上运行引物设计专业软件。
Per 5-mer
引物特异性分析
Oligo 6.44 使用说明
主要功能：专门的引物设计软件
Oligo 6.44 启动界面
Open sequence file
3个弹出窗口
Melting temperature
∆G Internal Stability
Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件 中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
引物设计界面 primer First you can design the
一般原则
2.性较高的序列， 否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC， 也会使错误引发机率增加。
一般原则
3.引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位 碱基在错配位置导致不同的扩增效率 ，末位碱基为A 的错配效率明显高于 其他3 个碱基，因此应当避免在引物 的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体 或发夹结构也可能导致PCR 反应失败 。5’端序列对PCR 影响不太大，因此 常用来引进修饰位点或标记物。
一般原则
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切 位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
常用的引物设计软件
Primer Premier （自动搜索）* Oligo 6 （引物评价）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
引物分析

二项检查是发夹结构（hairpin）；与 二聚体相同，发夹结构的能值越低越 好。
引物分析
第三项检查为GC 含量，以45-55％为 宜。 第四False priming 检查

引物分析 of primer Key information
Dimer and cross Dimer Hairpin
一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%， 过高或过低都不利于引发反应。上下 游引物的GC含量不能相差太大。
一般原则
5. ∆G 值是指DNA双链形成所需的自由能 ，该值反映了双链结构内部碱基对的 相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低 （绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。 引物的3’端的∆G 值过高，容易在错 配位点形成双链结构并引发DNA 聚合 反应。（能值越高越容易结合）
用Oligo 设计引物时的3个标准
Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有 利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的 片段。 Δ G 值在5’端和中间值比较高，而在3’ 端相对低

选中引物
上游引物
下游引物 只是示意图
引物分析

首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体 形成的可能性。
GC%
Total PCR information
Final PCR information
Search for primer using Oligo 6.44
Search primer
Online primer3 service

/
manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
引物搜索选项设定
引物类型 搜索模式 引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
搜索结果
28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信 息