辣木凝乳酶水解酪蛋白位点及其酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽

辣木凝乳酶水解酪蛋白位点及其酪蛋白
磷酸肽、酪蛋白糖巨肽
施娅楠，张家艳，黄艾祥*
（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201）
摘 要：基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，液相色谱-串联质谱法研究辣木凝乳酶对酪蛋白的酶切位点和水解特性，并分析该凝乳酶水解产生的酪蛋白糖巨肽和酪蛋白磷酸肽。

结果表明，辣木凝乳酶酶切κ-酪蛋白的Arg 93-His 94 位点导致凝乳，区别于其他已报道的凝乳酶，具有明显特异性。

酶作用下κ-酪蛋白的米氏常数K m=0.49 mg/mL，最大反应速率V m=45.2 U/min，有效促进酪蛋白胶束的聚集和凝乳。

该酶对α-、β-、κ-酪蛋白产生不同程度的水解，对α-酪蛋白的水解速度最快，说明其适用于软质奶酪的加工。

以酪蛋白为底物，通过钡-乙醇沉淀法得到酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs），产率为15.87%，得到的CPPs可以使钙沉淀推迟23 min，有利于钙离子被肠道有效吸收。

以水牛乳为底物时，乳凝固后析出的乳清中含酪蛋白糖巨肽6.61 mg/mL，糖基化程度477.527 μg/mg。

研究为新型植物凝乳酶的研发，及其在奶酪、酪蛋白活性肽等产品的应用提供科学依据。

关键词：辣木凝乳酶；酶切位点；κ-酪蛋白；酪蛋白磷酸肽；酪蛋白糖巨肽
Hydrolysis Site of Casein by Milk-Clotting Protease from Moringa oleifera Lam. and Preparation and
Evaluation of Casein Phosphopeptide and Casein Glycomacropeptide
SHI Yanan, ZHANG Jiayan, HUANG Aixiang*
(College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China) Abstract: In this study, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were used to explore the cleavage site and hydrolysis characteristics of casein by a milk-clotting protease from Moringa oleifera Lam. Then, casein phosphopeptide and casein glycomacropeptide in the resulting hydrolysate were analyzed. The results showed that the protease could specifically cleave κ-casein at the Arg93-His94 site leading to milk clotting, which is distinct from other reported chymosins. The Michaelis constant (K m) and maximum reaction rate (V m) of the milk-clotting protease were 0.49 mg/ml and 45.2 U/min, respectively, and it could promote the aggregation and coagulation of casein micelles. The enzyme could hydrolyze α, β and κ-casein to different extents and exhibit the fastest hydrolysis rate toward α-casein, indicating that it was suitable for the processing of soft cheese.
Casein phosphopeptide (CPP) was obtained by barium-ethanol precipitation method with casein as the substrate, with a yield of 15.87%. CPP could delay the precipitation of calcium by 23 min, which was beneficial to the intestinal absorption of calcium. When buffalo milk was used as the substrate, the concentration of casein glycomacropeptide (CGMP) was
6.61 mg/mL in whey, and the degree of glycosylation was 47
7.527 μg/mg. This study provides an important theoretical basis
for the development and application of new plant chymosins in cheese and casein-derived bioactive peptides.
Keywords: Moringa oleifera Lam. milk-clotting protease; enzyme cleavage site; κ-casein; casein phosphopeptide; casein glycomacropeptide
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200322-322
中图分类号：TS252.1 文献标志码：A文章编号：1002-6630（2021）10-0104-07
收稿日期：2020-03-22
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31560431）；云岭产业技术领军人才项目（云发改人事（2014）1782号）第一作者简介：施娅楠（1992—）（ORCID: 0000-0002-8813-8594），女，博士研究生，研究方向为乳品科学。

E-mail:********************
*通信作者简介：黄艾祥（1963—）（ORCID: 0000-0003-4148-8455），男，教授，博士，研究方向为食品新资源开发与乳品科学。

E-mail:********************
引文格式：
施娅楠, 张家艳, 黄艾祥. 辣木凝乳酶水解酪蛋白位点及其酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽[J]. 食品科学, 2021, 42(10): 104-110. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200322-322.
SHI Yanan, ZHANG Jiayan, HUANG Aixiang. Hydrolysis site of casein by milk-clotting protease from Moringa oleifera Lam. and preparation and evaluation of casein phosphopeptide and casein glycomacropeptide[J]. Food Science, 2021, 42(10): 104-110. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200322-322.
凝乳酶是奶酪加工的必需酶制剂。

随着全球奶酪产量的增加，越来越多的植物凝乳酶被研究。

从番木瓜、菠萝、姜根茎和洋蓟花中提取的几种植物凝乳酶已成功地应用到奶酪的生产中[1]。

在云南少数民族地区，人们利用贯筋藤、青羊参等植物浸泡后产生的溶液，作为凝固剂制作乳饼、奶酪。

然而，不同的植物提取凝乳酶也被证明含有特定的活性成分、不同的酶切位点和最佳应用条件，利用特定酶切位点的凝乳酶切割酪蛋白会产生一些功能活性肽，如酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）、酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）、抗菌肽、抗氧化肽、抗血栓肽、免疫活性肽等[2-4]。

辣木叶（Moringa oleifera Lam. leaf），是一种经中国卫生部批准的新食品原料。

近年来，国内外学者对辣木基因组学、蛋白质组学、化学成分、功能活性成分、药理活性、钙的生物学价值及安全性开展了系列研究工作[5]。

辣木叶富含蛋白质（鲜叶约6%、干叶约27%），是饮食和动物饲料中蛋白质的重要来源[6-7]，当前对辣木叶蛋白的研究主要集中在蛋白酶抑制剂、糖蛋白及凝乳特性等方面[8]。

研究表明，辣木花、叶、籽均具有酪蛋白水解活力和凝乳活力，其中辣木花凝乳成分是天冬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和Ca2+依赖性蛋白酶的混合物[9]；从辣木籽中分离得到的主要凝乳成分是一种天冬氨酸凝乳酶[10]。

辣木叶中分离鉴定了一种丝氨酸内肽酶，凝乳活力与水解活力比可达126.76，分子质量56.146 kDa，等电点5.27，在65 ℃时达到最大凝乳活力，在温度35～75 ℃之间活力稳定。

辣木凝乳酶的最适反应pH值为8.0，酶活力在pH值4.0～9.0之间稳定[11]，因此，辣木凝乳酶是一种极具发展潜力的植物型凝乳酶。

凝乳酶首先水解位于酪蛋白表面的κ-酪蛋白（κ-CN），使包裹在里面的α-酪蛋白（α-CN）、β-酪蛋白（β-CN）暴露，进而与Ca2＋结合形成沉淀，导致凝乳[12]。

小牛皱胃酶是一种经典的凝乳酶，在牛乳凝固过程中特异性水解κ-CN的Phel05-Metl06肽键[13]。

从豆蔻中纯化的天冬氨酸蛋白酶，酶切Phe105-Met106、Lys116-Thr117导致凝乳[14]。

江米酒中分离得到的分子质量36 kDa凝乳酶，通过飞行时间质谱检测其在κ-CN中的水解位点为Thr94-Met95[15]。

Egito等[16]报道了合欢和葵花籽凝乳酶的酶切位点分别为Lys116-Thr117和Phe105-Met106。

Huang等[17]从新鲜生姜中分离并提取31 kDa蛋白酶，能水解α-CN、κ-CN和β-CN，其中对α-CN的水解能力最强，对κ-CN 的水解位点为Ala90-Glu91和His102-Leu103。

云南当地的2种野生植物贯筋藤和青羊参，是制作乳饼的乳凝乳剂，该凝乳酶的酶切位点分别是Ala90-Gln91和Ser132-Thr133[18-19]。

本研究旨在分析辣木凝乳酶的酶切位点及其对酪蛋白的水解特性，对酶切产生的酪蛋白磷酸肽和酪蛋白糖巨肽进行研究。

以期为辣木凝乳酶在奶酪、乳饼加工，及其定向水解乳蛋白获得特定功能性水解产物，功能性乳制品的研发提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料：辣木凝乳酶为本实验室筛选、纯化，其凝乳活力为253.27 SU/mL，最适温度65 ℃，最适pH 8.0。

蛋白Marker、酪蛋白、α-CN、β-CN和κ-CN 美国Sigma-Aldrich公司；木瓜蛋白酶（酶活力为8×105 U/g）上海源叶生物科技有限公司；小牛皱胃酶（酶活力为3×105 U/g）生工生物工程（上海）股份有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（5×）中国Biosharp生物公司；SDS-PAGE凝胶速配试剂盒美国GenScript公司；唾液酸测定试剂盒南京建成生物工程研究所。

其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备
TGL20M高速冷冻离心机湖南湘立科学仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机上海比朗仪器制造有限公司；电泳仪、电泳自动成像仪美国Bio-Rad公司；Orion Star T900自动电位滴定仪、Q Exactive四极杆质谱仪、Easy-nLC1000液相色谱仪赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法
1.3.1 酪蛋白水解分析
根据Huang等[17]的研究测定酪蛋白水解程度。

将辣木凝乳酶、α-CN、β-CN和κ-CN（各50 mg）分别溶于10 mL的10 mmol/L柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中制备。

辣木凝乳酶以1∶10（V/V）的比例与κ-CN在65 ℃
反应4 h，并以小牛皱胃酶作为对照；辣木凝乳酶以1∶10（V/V）的比例分别与α-CN、β-CN作用，在65℃反应15、30、60 min。

同样，辣木凝乳酶与κ-CN在65 ℃反应5、10、15、30、45、60、120 min，利用SDS-PAGE（上样量5 μL）分析酪蛋白水解程度。

蛋白上样量为15 μL，利用SDS-PAGE和ImageJ软件分析3 种酪蛋白组分的水解程度。

1.3.2 蛋白酶对κ-CN裂解位点的分析
根据Luo Jie等[19]的研究进行一定修改。

将κ-CN溶解于浓度为10 mmol/L柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH 6.5），并调节溶液浓度为5 mg/mL。

分别将辣木凝乳酶和小牛皱胃酶与κ-CN以1∶110的比例混合，然后在65 ℃反应40 min，以完全确保乳蛋白凝固。

将混合物与载样液在95 ℃处理5 min，然后利用SDS-PAGE进行分离。

从凝胶中切下目标蛋白条带进行纳升级液相色谱-串联质谱（Q exactive nano-liquid chromatograph-mass spectrometry，nano-LC-QE-MS/MS）分析。

具体操作步骤如下：
1）供试品酶解：供试品经过还原和烷基化处理后，加入Trypsin（质量比1∶50），在37 ℃酶解20 h。

酶解产物脱盐后冻干，复溶于体积分数为0.1%的氟乙酸溶液中，－20℃保存待用。

2）色谱分析：A液为体积分数0.1%的甲酸溶液，B液为体积分数0.1%甲酸的乙腈溶液（乙腈体积分数为84%）。

色谱柱以体积分数95%的A液平衡后，样品由自动进样器上样至Trap柱。

0.5 H梯度。

3）色谱数据采集：多肽和多肽碎片的质荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20 个碎片图谱（MS2 scan）。

4）数据分析：质谱测试原始文件用Mascot2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。

搜库参数如下：酶：胰蛋白酶；数据库：uniprot_Bos_ taurus_46721_20191014；漏切点：2；肽质量误差范围：20×10－6；碎片质量误差范围：0.1 Da。

1.3.3 辣木凝乳酶作用下的κ-CN动力学分析
根据Nafiet等[20]的研究进行了一些修改。

将5 mg/mL 的κ-CN储备溶液溶解于10 mmol/L柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中，然后用缓冲液稀释至质量浓度0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。

首先将稀释溶液在65 ℃孵育5 min，然后按酶与底物比1∶10（V/V）的比例添加辣木凝乳酶。

反应10 min后，立即加入相同体积的5%三氯乙酸溶液终止反应。

动力学参数Michaelis常数（K m）、最大反应速率V m使用Line-weaver-Burk图计算。

1.3.4 水解酪蛋白制备CPPs
配制质量浓度为20 mg/mL的酪蛋白溶液，利用0.1 mol/L NaOH溶液在磁力搅拌器下使其完全溶解，分别加入辣木凝乳酶，小牛皱胃酶和木瓜蛋白酶，酶与底物的质量比为1∶70，于65 ℃恒温水解2 h，93 ℃热处理10 min 以终止反应。

CPPs提取采用钡-乙醇沉淀法[21]，另取不加蛋白酶的酪蛋白溶液测定酪蛋白内源CPPs的含量。

1.3.5 CPPs持钙能力测定
采用pH-stat法测定CPPs的持钙能力[22]。

称取CPPs冻干粉0.10 g，加100 mL 0.016 mol/L的NaH2PO4溶液将其溶解，并置于37 ℃水浴中反应，加入浓度为0.016 mol/L的CaCl2 100 mL，立即用0.1 mol/L NaOH溶液将反应体系调至pH 7.2，并不断滴加NaOH使反应液pH值保持恒定。

从调节pH值开始计时，在2 min内将反应体系调至pH 7.2，从2 min开始连续记录0.1 mol/L NaOH的消耗量。

以时间为横坐标，0.1 mol/L NaOH溶液的消耗量为纵坐标，得到持钙能力曲线。

以不加CPPs为对照。

1.3.6 水牛乳酶解液中CGMP的检测[23]
1.3.6.1 乳清中唾液酸含量的测定
κ-CN是酪蛋白中唯一含糖的蛋白质，唾液酸通过糖苷键与糖蛋白的糖链相连接并集中在酪蛋白糖巨肽上，因此唾液酸的含量可以表征CGMP。

辣木凝乳酶，木瓜蛋白酶和小牛皱胃酶与脱脂水牛乳（4℃、3 000×g离心10 min），酶的添加量（以脱脂水牛乳体积的7%）反应40 min使其形成稳定凝团，离心除去乳清中残留的大颗粒酪蛋白凝块（4 ℃、9 000×g离心10 min）。

然后，通过三氯乙酸沉淀法进一步除杂，上清截流于分子质量1 000 U透析袋，冷冻干燥（5～10 MPa，－50 ℃）。

采用唾液酸测定试剂盒测定唾液酸含量。

1.3.6.2 水解度测定
采用pH-stat法，水解度的计算公式为：
DH/%˙
h
h
tot
h100（1）h˙
B h N
b
a
1
MP
h（2）式中：h为单位质量蛋白质中被水解的肽键的量/（m m o l/L）；h t o t为单位质量蛋白质中肽键的总量/（mmol/L），乳酪蛋白的h tot为8.2 mmol/L；B为水解过程中的耗碱量/mL；N b为碱液浓度/（mol/L）；MP为水解液中蛋白质质量/g；a为校正系数（设辣木凝乳酶=1）。

1.3.6.3 CGMP的糖基化度
CGMP片段中唾液酸含量与蛋白质含量的比值越大，则糖基化度越大。

糖基化度为间苯二酚-盐酸法测定唾液酸在580 nm波长处的吸光度与水解液中蛋白含量的比值。

1.4
数据分析
所有数据均做3 次平行实验，使用SPSS 17.0统计软件
s表示，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析
2.1
辣木凝乳酶对κ-CN 的酶切位点
小牛皱胃酶对κ-CN 的高度特异性和稳定性，被广泛应用于奶酪加工，所产奶酪质地均匀，具有良好的风
味。

因此，本研究以小牛皱胃酶为阳性对照，研究辣木凝乳酶对κ-CN 的酶切位点及水解特性。

在所有酪蛋白组分中，κ-CN 在稳定酪蛋白胶束方面起着关键作用，凝乳过程中亲水性的部分被凝乳酶切断，而N 端疏水性的部分保留在蛋白胶束上。

由图1所示，凝乳酶与κ-CN 反应4 h 后，κ-CN 条带颜色变浅，在分子质量10～15 kDa 之间（约13 kDa ）形成明显的蛋白条带。

同时，经典的小牛皱胃酶水解κ-CN ，形成的蛋白条带同样位于分子质量
10～15 kDa 之间。

4 h
MO MO
M
Rennet κ-CN
4 h
4 h
0 h
25 kDa 15 kDa 10 kDa
MO.辣木凝乳酶；Rennet.小牛皱胃酶（对照组）；M.标准蛋白质。

图 1
辣木凝乳酶与κ-CN 反应4 h 的SDS-PAGE 图
Fig. 1
SDS-PAGE analysis of κ-CN hydrolyzed with milk-clotting
protease for 4 h
辣木凝乳酶与κ- CN 反应4 h 后，通过SDS-PAGE 获得该分子质量的电泳条带，从凝胶中切割κ-CN 条带，采用还原烷基化和胰蛋白酶消化后，利用nanoLC-QE-MS /MS 进行肽段序列鉴定，从而获得κ-CN 胶内酶解肽序列。

根据肽段Score 值，一般情况下肽段筛选的最低分为20，分值越高说明肽段二级图谱的匹配程度越好，表明对κ-CN 的酶切位点进行了有效鉴定。

从49 条肽段中得到4 条得分值最高的肽段，且均来自于κ-CN ，分别为：DERFFSDKIA （分子质量：1 229.11 Da ；Score 值：56.99）、YIPIQYVLSRY （1 251.71 Da ；49.52）、RSPAQILQWQVLSNTVPA （1 980.09 Da ，64.19）、SCQAQPTTMAR （1 266.56 Da ，51.54）（图2）。

根据胰蛋白酶优先在Arg 和Lys 处裂解[24]，通过对胰蛋白酶和重叠肽的去除，可以得出结论：通过查找数据库比对κ-CN 整个氨基酸序列确定辣木凝乳酶对κ-CN 的酶切位点为R-H ，即Arg 93-His 94。

将κ-CN 水解成分子质量为13 127.38 Da 的副κ-CN （f1-93）和分子质量为7 616.49 Da 的κ-CN （f94-169）片段。

质谱结果与电泳结果观察到的分子质量一致（约13 kDa ，图1）。

部分肽序列的缺失可能是由于κ-CN 进一步水解成小肽而引起的，小分子肽无法被质量分析器检测。

辣木凝乳酶的切割位点不同于其他已报道的动物、植物或微生物凝乳酶，
酶切位点的不同，使得奶酪加工工艺、干酪风味形成以
及生物活性肽功能各不相同，如不同于κ-CN 氨基酸切位点Phel05-Metl06的小牛凝乳酶，分析κ-CN 的水解位点是揭示其凝乳机制重要手段。

2028
1216248
4
604020080100⴨ Ѡ /%
䰤/min
9.079.6710.36
13.3813.6414.13
16.0517.51
18.0518.54
19.54
20.21
21.69
23.3225.21
26.03
27.5728.0210.04
2028
1216248
4
604020080⴨ Ѡ /%
䰤/min
8.779.73
10.13
10.43
12.6612.48
11.59
13.7914.39
15.14
17.5217.6018.14
19.3620.82
21.83
22.0525.50
27.5728.02
22.43
100Kappa-casein OS ＝Bos taurs GN ＝CSN3 PE ＝3 SV ＝1
图 2 辣木凝乳酶对κ-CN 酶切产物的basepeak 图及酶切位点Fig. 2
Basepeak plot and cleavage site of M. oleifera milk-clotting
protease toward κ-CN
辣木凝乳酶属于丝氨酸蛋白酶家族，酶切κ-CN 精氨酸与组氨酸之间的肽键形成凝乳，使之在奶酪加工中具有一定的潜力。

胰蛋白酶也是丝氨酸蛋白酶家族的成员之一，水解精氨酸或赖氨酸羧基所构成的肽链（除非这两个氨基酸之后有脯氨酸直接相连）[25]，该酶目前是质谱技术中常用的蛋白水解酶。

冯颖杰[26]纯化的米曲霉蛋白酶PA 能识别酪蛋白中-Cys-Gly-、-Glu-Ala-、-Arg-Gly-组成的肽键并选择性酶切，可制备功能性CPPs 和抗氧化活性肽。

大多数酪蛋白的酶解物可表现出较强的ACE 抑制活性，且C 末端具有带正电荷的精氨酸和赖氨酸能提高ACE 抑制活性。

亲水性氨基酸如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸及天冬氨酸等氨基酸残基与活性肽的过敏性有关，采用专一水解此类氨基酸残基的蛋白酶制备活性肽可以降低其过敏性[27]。

此外，在获得凝乳酶一级结构的基础上，也可实现虚拟酶解，结合现有的生物活性肽数据库，如BIOPEP 、EROP-Moscow ，揭示酶解肽片段潜在的生物活性。

2.2 辣木凝乳酶作用下κ-CN 的动力学参数
凝乳酶对κ-CN 的水解效率越高，酪蛋白胶束的聚集速度越快[28]。

因此，通过对κ-CN 酶动力学参数的评价，可以更好地了解其凝乳行为。

1/V /˄10ˉ2 m i n /U ˅1/[S ]/˄mL/mg ˅
图 3
以κ-CN 为底物的辣木凝乳酶动力学分析
Fig. 3
Kinetic analysis of κ-CN hydrolysis by milk-clotting protease
辣木凝乳酶水解κ-CN 的1/V 与1/[S ]曲线图如图3所
示。

K m 是产生最大速度值50%所需的基质浓度。

当底物浓度较低时，较低的K m 表示对底物的酶亲和力较高[29]， 反映了凝乳酶对κ-CN 的蛋白水解效率，有利于κ-CN 疏水性N 端部分的快速产生，形成稳定的蛋白胶束。

κ-CN 对辣木凝乳酶的K m 和V max 值分别为0.49 mg /mL 和 45.2 U /min 。

在65 ℃下，辣木凝乳酶的K m 值大于生姜蛋白酶的K m 值（0.237～0.359 mg /mL ）[17]，而与淀粉样芽孢杆菌D4中纯化的一种金属蛋白酶（K m 值为 0.471 mg /mL ）接近[29]，辣木凝乳酶对酪蛋白的亲和力高于毛霉属的天冬氨酸凝乳酶（K m 值为3.88 mg /mL ）。

2.3 辣木凝乳酶对α-、β-、κ-CN 的水解能力分析
辣木凝乳酶处理乳蛋白，可在40 min 内形成稳定、质地均匀的凝团。

为了进一步研究辣木凝乳酶的蛋白水解特性，利用SDS-PAGE 分析了酪蛋白组分在0～60 min 过程的水解情况，如图4～6所示。

酪蛋白水解的蛋白产物可以通过凝胶扫描定量，进行密度测定[30]。

M
01530
60
α-CN
35 kDa 25 kDa 15 kDa 10 kDa
䰤/min M.标准蛋白质，下同。

图 4 辣木凝乳酶与α-CN 不同反应时间的SDS-PAGE 图
Fig. 4
SDS-PAGE analysis of α-CN hydrolyzed with milk-clotting
protease for different timeframe
由图4可知，α-CN 在15 min 的反应时间即可发生较大程度的水解，形成分子质量低于15 kDa 的蛋白产物，说明辣木凝乳酶对α-CN 敏感，能在短时间破坏其空间结构。

反应60 min ，蛋白条带明显变浅或消失。

Jiang 等[15]的研究表明，江米酒凝乳酶是另一种制作宫廷奶酪的酶制剂，同样的，相较于β-CN ，该酶对α-CN 和κ-CN 表现出更高的水解能力，在反应5～30 min 发生大规模水解。

辣木凝乳酶水解60 min 时，α-CN 的条带颜色变浅，说明蛋白被水解为分子质量小于25 kDa 的蛋白质或
多肽。

Hayaloglu 等[31]小牛皱胃酶和米黑根茎凝乳酶是制作Malatya 干酪的酶制剂，具有较强的α-CN 水解程度，表现为质地较软和融化性较好。

De Jong 等[32]通过单轴压缩实验表明，切达干酪的压缩百分比和断裂力的降低与成熟过程中α-CN 的快速水解有关，与成熟期间的软化程度呈正相关。

M
01530
60
β-CN
35 kDa
25 kDa 15 kDa 10 kDa
䰤/min 图 5 辣木凝乳酶与β-CN 不同反应时间的SDS-PAGE 图
Fig. 5
SDS-PAGE analysis of β-CN hydrolyzed with milk-clotting
protease for different timeframe
由图5可知，在反应时间为15 min 时，β-CN 水解为分子质量10～15 kDa 的蛋白质，随着反应时间的延长，β-CN 逐渐水解为分子质量更低的小分子蛋白。

辣木凝乳酶对β-CN 水解速度比α-CN 慢，β-CN 作为酪蛋白疏水性最强的蛋白质，在水解过程中，疏水性氨基酸残基在多肽链中易形成空间位阻，阻碍酶解反应[33]。

Cavalli 等[30]对水飞蓟提取物水解α-CN 和β-CN 酪蛋白的动力学分析表明，α-CN 比β-CN 酶解更迅速，且水解产物更加广泛。

微生物凝乳酶除了能水解κ-CN 外，也容易水解α-和
β-CN 中的某些肽键，但对α-和β-CN 的磷酰胺键水解较为缓慢。

干酪成熟过程中的流变学特征变化复杂，主要受α-CN 、β-CN 影响，α-CN 的水解程度与干酪硬度成负相关，而β-CN 的水解则与干酪融化性呈负相关，与硬度呈正
相关[34]。

干酪成熟过程中蛋白质水解对风味特性也有着极其重要的影响。

早期研究，植物源凝乳酶过度水解α-CN 、β-CN 后会产生苦味肽，使得其被限制使用，但不同的植物凝乳酶酶切形成的肽段大不相同，使得从植物中提取新型凝乳酶的探索仍然在继续。

M
5
1015304560120
10 kDa
15 kDa 副κ25 kDa 䰤/min
图 6 辣木凝乳酶对κ-CN 不同反应时间的SDS-PAGE 图
Fig. 6
SDS-PAGE analysis of κ-CN hydrolyzed with milk-clotting
protease for different timeframe
乳蛋白中，κ-CN 的水解是导致凝乳的核心因素。

辣木凝乳酶与κ-CN 之间的反应如图6所示，反应5 min 时，副κ-CN 立即产生，这对于凝乳效果、酪蛋白胶束的聚集极为重要。

反应10～45 min 内，代表了在早期反应阶段形成的产物，该过程水解较为缓慢，蛋白分子质量均分布于10～15 kDa 之间。

有研究表明，只有当足够的κ-CN 被水解时，通常水解度要达到80%～90%时凝乳状态最好，此时大量的副产物发生聚集形成三维网状凝胶[32]。

水解至60 min 时，除副κ-CN 外，其余蛋白条带被水解。

2.4 辣木凝乳酶水解酪蛋白生成CPPs 及其持钙能力
经测定，酪蛋白内源性CPPs 含量为3.71%；酪蛋白经辣木凝乳酶水解后，CPPs 含量为19.58%，净产率为15.87%。

在相同的条件下，利用小牛皱胃酶获得的CPPs 产率为29.17%，净产率25.46%；利用木瓜蛋白酶获得的CPPs 产率为21.55%，净产率17.84%。

ˉ N a O H ⓦ⏢փ〟/m L
䰤/min
图 7 酪蛋白磷酸肽持钙能力
Fig. 7
Calcium-binding ability of CPPs
持钙能力是CPPs 的功能性指标，是检测其品质的有效手段，pH-stat 法是测定CPPs 持钙能力普遍采用的方法。

在弱碱性条件下，NaH 2PO 4与CaCl 2形成Ca 3(PO 4)2会释放H +，在维持体系pH 值不变的同时，NaOH 溶液的加入量与Ca 3(PO 4)2形成量一致。

如图7所示，未加CPPs 时磷酸钙沉淀迅速形成；加入辣木凝乳酶制备的CPPs 后，CPPs 与溶液中的钙离子结合形成较稳定的络合物，在碱性条件缓慢形成沉淀，于23 min 沉淀完全，CPPs 推迟钙离子沉淀的效果，有利于钙离子被肠道有效吸收。

在同等条件，木瓜蛋白酶与小牛皱胃酶分别为25 min 和30 min （P ＜0.05）。

陈雪香等
[22]
研究了8 种商品所含
CPPs 的持钙能力，其中7 种CPPs 延缓钙离子沉淀的时间在18～29 min 之间，本研究从一定程度上反映出辣木凝乳酶水解获得的CPPs 具有较好的品质。

辣木凝乳酶具备较大的开发潜力，可以进一步通过优化酶解条件获得更高产率和纯度的酪蛋白磷酸肽。

2.5 酶解液的水解度、糖基化程度和CGMP 的含量
如表1所示，辣木凝乳酶、木瓜蛋白酶和小牛皱胃酶可以很好地水解水牛乳酪蛋白，而木瓜蛋白酶对酪蛋白水解作用最强（P ＜0.05）。

辣木凝乳酶制备CGMP 的研究表明，在CGMP 的含量及其糖基化度等方面均与商业化凝乳酶（木瓜蛋白酶、小牛皱胃酶）无显著差异
（P ＞0.05）。

到目前为止，有关CGMP 的生理功能和对机体健康的生物学功效已有较多的报道[35]，CGMP 的糖链含量十分丰富，使其在婴儿食品、标准化食品中提供了一种功能因子，而且能增加乳、奶酪等乳制品的附加值。

此外，水牛乳酪蛋白经过辣木凝乳酶水解后，水解液经进一步纯化所得肽段（命名为BCp08）对4 种食源性致病菌，特别是对5 种多重耐药致病菌具有较强的抑制活性，分别是耐PEN （青霉素）、OXA （苯唑西林）、ERY （红霉素）、CLI （克林霉素）、CFX （头孢西丁）的金黄色葡萄球菌，相关工作仍在研究中。

表 1
酶解液的水解度、糖基化程度和CGMP 含量Table 1
Degree of hydrolysis, degree of glycosylation and CGMP
content of enzymatic hydrolysates
酶种类水解度/%糖基化程度/（μg /mg ）CGMP 质量浓度/（mg /mL ）辣木凝乳酶29.111±1.124a 477.527±13.446a 6.610±0.571a 木瓜蛋白酶33.040±0.972a 533.316±9.001a 6.454±1.032a 小牛皱胃酶
24.956±1.031b
532.777±10.798a
8.091±1.564a
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P ＜0.05）。

3 结 论
研究κ-CN 的水解位点是揭示其凝乳机制的重要手
段，辣木凝乳酶对κ-CN 的酶切位点为Arg 93-His 94，具有明显特异性。

酶切酪蛋白可在较短时间内生成分子质量13 127.38 Da 的副κ-CN ，有效促进酪蛋白胶束的聚集和凝乳。

酶凝的过程中对α-CN 、β-CN 产生不同程度的水解，对α-CN 的水解速度最快，表明在软质奶酪的加工具有较高的应用前景。

辣木凝乳酶水解酪蛋白产生丰富的酪蛋白糖巨肽和酪蛋白磷酸肽，增强了乳制品的生物学价值。

研究为新型植物凝乳酶、及其定向水解乳蛋白获得特定功能性水解产物，功能性乳制品的研发提供科学依据。

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