动物基因工程及应用_PPT幻灯片
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精卵后，发育成的动物个体理论上应具有抗病毒或获 得优良性状的表型。如：将人的促生长激素具有转入 鱼体内可提高其生长速度5倍；用胞内免疫法已培养出 抗鸡白细胞组织增生病毒的转基因鸡新品种和抗流感 病毒的转基因小鼠；将抗冻蛋白基因转入鲑鱼中，使 其在冰窟中也能繁殖；澳大利亚培育出的转基因山羊， 羊毛增产5%.
slide1本课程内容?第一章绪论?第二章基因克隆的工具酶?第三章基因工程的载体?第四章目的基因的制备?第五章目的基因导入和重组子的筛选?第六章外源基因的表达?第七章基因操作的基本技术?第八章植物基因工程及应用?第九章动物基因工程及应用?第十章医学基因工程及应用10192018欢迎同学们听课
第九章 动物基因工程及应用
第一节 动物基因工程的基本概念 第二节 动物基因基因转移的方法 第三节 动物基因工程应用
3/8/2021
欢迎同学们听课！
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引言
• 20世纪70年代末至80年代初，借助于受精卵显 微注射和早期胚胎细胞的逆转录病毒感染等手 段，将功能基因引入高等动物的染色体DNA上， 实现了种系内和种系间细胞的基因转移。 多利绵羊克隆的成功，意味着不仅可以将 任何基因转入包括人体在内的任何细胞中，而 且还能使转基因动物像重组微生物那样繁殖。
3) 新霉素抗性基因（neor）赋予受体细胞对 G418的抗性
4) 胸腺嘧啶激酶基因（tR1、tR2），来自单纯 疮疹病毒基因组的I型II型不同基因。tR基因实质上是 自杀基因，其产物可将一种化合物（Gancyclovir，
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GCV）转化成对细胞毒性的化合物，杀死细胞。 II 转基因ES细胞的筛选 1) 正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：通过
转基因进入动物细胞后，如果受体细胞基因组上 也有存在着同源伙伴，那么转基因的功能研究就会受 到限制。在微生物中，通常是通过突变体研究基因的 功能。但在动物细胞中，由于大量内含子及非编码顺 序的存在，降低了突变频率。因此大都采用内源基因 定向灭活的方法。
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物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素 G418的培养基中体外培养ES 细胞。由于重组分子是 复制缺陷型的，所以在子代ES细胞中，重组分子已经 转化入ES细胞的基因组中。
2) 负选择法筛选出特异整合型ES细胞：如果非 特异性整合发生，则两个tR基因或其中一个基因很大 可能与TG和neor一起整合，这时用GCV筛选，其表达 产物将杀死非整合型ES细胞，而特异性整合是通过双 交叉同源交换实现的。因此两个tR基因就被排除，显 示出GCV抗性，并生长。
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• II 优缺点： 1) 优点：能有效地将转基因整合入受体
细胞的基因组内，单拷贝整合型；转基因整合 后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在TR区 域内进行，不会破坏转基因结构
2) 缺点：载量较小一般只有8kb可能会因 缺少必须的调控元件而影响转基因表达；尽管 种系载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细 胞的包装过程中，若与整合型辅助表达基因组 发生同源重组，就有可能组装成野生型逆转录 病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因 动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。
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3) PCR法鉴定整合型ES细胞：制备ES 细 胞染色体DNA，设计PCR引物，进行PCR扩增， 鉴定外源基因是否在受体细胞中存在。
P1：与neor基因同源（动物细胞内不存在neor 基因）
P2：与ES细胞染色体HB1基因左边外围邻近区 域同源（CS区） 不幸的是ES的多效性并没有发现在：牛、羊、 猪、鸡中。
• 二、基因转移的方法 动物基因转化的方法主要有：物理转化法，病毒
介导法和工程胚胎干细胞法。常用的方法主要有以下 几种。 （一）逆转录病毒感染法 I 基本程序：
1) 构建逆转录病毒DNA与质粒DNA的异源DNA 型克隆载体。
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• 2) 克隆基因重组异源DNA型载体，在大肠杆菌 等原核受体细胞中筛选、鉴定重组体。
b. 反义RNA或反义DNA抑制内源基因表达 这种战略是通过抑制mRNA转录而关闭内源基因，
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欢迎同学们听法有： 1） 反义RNA体外合成：由mRNA作模板，细菌
RNA聚合酶催化合成mRNA的反义RNA显微注射进入 受体细胞，阻止细胞内源基因的表达。
在体外培养时，ES细胞能方便地承受转基因操作 而不影响其分化多效性，利用这个系统，一个功能转 基因可被整合在ES细胞基因组中的一个非必须基因的 特异位点上，构成工程化胚胎干细胞，经过筛选鉴定， 体外增殖，最后输回小鼠胚胎胚泡中，形成转基因动 物，在这种方法中，整合的随机性可以避免。
绝大多数的ES细胞不能整合DNA，采用正负选择 方法可将整合在特异位点上的转基因ES细胞选出，并 在体外富集这种细胞。
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（二）DNA显微注射法
I 基本程序： 1) 通过激素疗法使田鼠超数排卵，48小时后再注
射人绒毛膜促进腺激素，这时田鼠便会超数排卵，一 般情况下5-10个，超数排卵为35个。
2) 与雌性小鼠交配，然后杀掉田鼠，从其输卵管 内取出受精卵。
3) 将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变 大的雄性原核内。
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I 转基因选择载体的构建 转基因选择载体通常包括下列部分：
1) 两个同源DNA片段（HB1,HB2），它们与ES 细胞中某一必需基因两端同源，保证转基因及标记基 因neor通过同源交换定向整合在ES的这一非必需基因 内部。
2) 转基因（TG），必须能赋予受体ES细胞新 的功能。
4) 将25-40个注射转基因的受精卵移植入田鼠体内。 5) 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代
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6) 从小鼠子代体内提取DNA样品，杂交鉴定转基因的 整合与否及位点。
7) 子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗 传及表达
II 优缺点： 1) 优点：转基因范围广，且可转移较大DNA片
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I 共抑制效应的特征 i 共抑制只发生在转基因与同源基因之间，而不
影响其它基因的表达。 ii 转基因与内源基因发生体内重组后，共抑制
效应消失，基因表达恢复正常。 iii 共抑制现象的发生与结构编码区有关，而与
启动子的来源无关。 iv 两个相同的转基因之间也发生共抑制效应，
这也许是转基因动植物中单拷贝的转基因通常具有最 高表达率的原因。
II 共抑制效应的产生机制假说 i 转基因与同源基因相互作用，形成某种后成状
态而影响两者的表达
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ii 转基因与内源基因因竞争性结合核基质，核包 膜上转录翻译必须的不扩散元件而出现相互抑制。
iii 两者形成互为反义RNA，使之失活并快速降 解。
2） 单链DNA体外合成：根据靶基因顺序，体外 设计并合成一小段DNA单链（反义DNA），它与靶基 因mRNA5'端的翻译起始区互补，并抑制其翻译。然 后将高浓度的单链反义DNA片段直接加入细胞培养基 中，由于这种反义DNA分子量小，细胞会以较低的频 率吸收。如果将这些反义DNA进行一些化学修饰，那 么共转化效率和胞内的稳定性均会大幅度提高。
iv 由于外源基因的存在，mRNA大量积累，并 激活某些未知酶素，导致mRNA降解。
III 转基因失活的可能原因：有时，转基因单方面 失活，其同源的内源基因仍表达。
i 转基因被受体细胞识别为异己DNA，并将之甲 基化修饰，使其失活。
ii 转基因整合在不合适的染色体部位，受局部 区域的影响而不表达。
iii 转基因本身的结构对其表达的影响因素，如 调控元件，内含子结构的存在与否等等。
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第三节 动物基因工程应用
• 动物基因工程的应用主要体现在以下三个方面： a. 研究基因的表达与功能 b. 改良物种（牛、鼠、羊、猪、鸡、鱼） c. 作为生物反应器生产重组蛋白，主要是医药。在
人类中，基因工程的主要用途是基因治疗。 一、利用动物转基因技术研究基因的表达与功能
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• 2.腺病毒（Adenovirus） 线状双链DNA，36kb,包装上限37.8kb, 修饰后上限4kb。 3.牛痘病毒 185kb，操作困难, 先以重组病毒感染细胞，使其大量 表达T7 RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启
动子的细菌重组质粒以脂质体的方式导入细胞。经过 一段时间预培养，外源基因即在T7 RNA聚合酶作用下 转录并翻译出异源蛋白。
段，可达数百kb；转基因不含任何病毒基因组片段， 绝对安全。
2) 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合， 多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成 转动物基因组的重排、突变、易位缺失等。
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三、工程胚胎干细胞法
多效性胚胎干细胞（ES）：胚胎发育到卵泡阶段的 细胞能在培养基中体外扩增，重新输入到胚胎胚泡后， 仍保留分化成其他细胞的能力。
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一般的，显微注射可达几kb-250kb；酵母人工染色体 （YAC)转基因至胚胎干细胞可达670kb；病毒为载体 可转移的片段一般不超过20kb。 （二）转基因的共抑制效应（Co-suppression） 在转基因动物的研究中，转基因的表达特性常会 出现许多出人意料又难以解释的现象。其中最普遍的 现象便是转基因的失活，也称为转基因的沉默，这种 现象在转基因动植物中均有发生。迄今为止，转基因 的失活现象在转基因植物中研究得较深入。研究表明， 转基因的失活机制是转基因与内源基因（同源基因） 的共抑制效应，即当受体细胞基因组中含有转基因的 同源基因时，转基因与内源基因的表达同时受到抑制.
3） 反义RNA的体内表达载体构建：构建原理是 将靶基因反向接在一个强启动子的下游，
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• 将这一反义RNA分子，并以绝对的浓度优势，与细胞 内靶基因mRNA结合，这些双链杂交分子不久便被 RNase水解掉。 c. 利用报告基因探测调控序列
• 二、改良动物遗传性状 将抗病毒基因或编码优良性状的基因转入动物受
• 转基因技术在基因研究中的应用，大致有三种情况： a. 同源重组灭活细胞内源基因 转基因进入动物细胞内后，通常会发生随机整合，
这不能灭活内源同源基因。但当转基因与细胞内基因 组中某区域具有高度同源性时，转基因便能准确地与 基因组中的同源重组。但在高等哺乳类动物体内则十 分罕见，其同源重组频率只及随机整合的千分之一。 然而，如果在转基因结构中，携带一个灵敏的标记基 因，便能有效地区分同源重组与随机整合，筛选出所 期望的细胞株，并将之输回雌性动物的胚胎中。在其 子代体内观察转基因的表型。
4.逆转录病毒 整合型单链RNA病毒，装配大小8kb。感染后，由逆 转录酶作用下，形成双链DNA，插入寄主基因组复制， 转录成mRNA，装配分泌到胞外，不造成宿主细胞死 亡。
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5. pBR322和BVP分子的穿梭载体 在动物基因工程中，经常使用启动子有以下几种： 热休克基因家族启动子pHS（热休克因子诱导） 病毒长末端重复序列启动子（糖皮质激素） 金属硫蛋白基因启动子（重金属诱导）
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第二节 动物基因基因转移的方法
• 一、动物基因工程的载体 动物基因工程的载体主要有以下几种： １.猿病毒（SV40） 双链环状DNA，5226bp
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SV40的结构
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3) 通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 系（通常是小鼠细胞系）
采用的方法包含：磷酸钙沉淀法，DNA+磷酸缓 冲+CaCL2电穿孔法，脂质体包埋法 4) 重组DNA分子转录出RNA重组分子，包装细 胞合成包装蛋白包装成熟颗粒。
5) 收集逆转录重组病毒，感染8细胞阶段的小鼠 胚胎细胞。
6) 利用标记基因筛选整合型转基因胚胎细胞。 7) 移植入小鼠母体体内。
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第九章 动物基因工程及应用
第一节 动物基因工程的基本概念 第二节 动物基因基因转移的方法 第三节 动物基因工程应用
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引言
• 20世纪70年代末至80年代初，借助于受精卵显 微注射和早期胚胎细胞的逆转录病毒感染等手 段，将功能基因引入高等动物的染色体DNA上， 实现了种系内和种系间细胞的基因转移。 多利绵羊克隆的成功，意味着不仅可以将 任何基因转入包括人体在内的任何细胞中，而 且还能使转基因动物像重组微生物那样繁殖。
3) 新霉素抗性基因（neor）赋予受体细胞对 G418的抗性
4) 胸腺嘧啶激酶基因（tR1、tR2），来自单纯 疮疹病毒基因组的I型II型不同基因。tR基因实质上是 自杀基因，其产物可将一种化合物（Gancyclovir，
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GCV）转化成对细胞毒性的化合物，杀死细胞。 II 转基因ES细胞的筛选 1) 正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：通过
转基因进入动物细胞后，如果受体细胞基因组上 也有存在着同源伙伴，那么转基因的功能研究就会受 到限制。在微生物中，通常是通过突变体研究基因的 功能。但在动物细胞中，由于大量内含子及非编码顺 序的存在，降低了突变频率。因此大都采用内源基因 定向灭活的方法。
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物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素 G418的培养基中体外培养ES 细胞。由于重组分子是 复制缺陷型的，所以在子代ES细胞中，重组分子已经 转化入ES细胞的基因组中。
2) 负选择法筛选出特异整合型ES细胞：如果非 特异性整合发生，则两个tR基因或其中一个基因很大 可能与TG和neor一起整合，这时用GCV筛选，其表达 产物将杀死非整合型ES细胞，而特异性整合是通过双 交叉同源交换实现的。因此两个tR基因就被排除，显 示出GCV抗性，并生长。
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• II 优缺点： 1) 优点：能有效地将转基因整合入受体
细胞的基因组内，单拷贝整合型；转基因整合 后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在TR区 域内进行，不会破坏转基因结构
2) 缺点：载量较小一般只有8kb可能会因 缺少必须的调控元件而影响转基因表达；尽管 种系载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细 胞的包装过程中，若与整合型辅助表达基因组 发生同源重组，就有可能组装成野生型逆转录 病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因 动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。
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3) PCR法鉴定整合型ES细胞：制备ES 细 胞染色体DNA，设计PCR引物，进行PCR扩增， 鉴定外源基因是否在受体细胞中存在。
P1：与neor基因同源（动物细胞内不存在neor 基因）
P2：与ES细胞染色体HB1基因左边外围邻近区 域同源（CS区） 不幸的是ES的多效性并没有发现在：牛、羊、 猪、鸡中。
• 二、基因转移的方法 动物基因转化的方法主要有：物理转化法，病毒
介导法和工程胚胎干细胞法。常用的方法主要有以下 几种。 （一）逆转录病毒感染法 I 基本程序：
1) 构建逆转录病毒DNA与质粒DNA的异源DNA 型克隆载体。
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• 2) 克隆基因重组异源DNA型载体，在大肠杆菌 等原核受体细胞中筛选、鉴定重组体。
b. 反义RNA或反义DNA抑制内源基因表达 这种战略是通过抑制mRNA转录而关闭内源基因，
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RNA聚合酶催化合成mRNA的反义RNA显微注射进入 受体细胞，阻止细胞内源基因的表达。
在体外培养时，ES细胞能方便地承受转基因操作 而不影响其分化多效性，利用这个系统，一个功能转 基因可被整合在ES细胞基因组中的一个非必须基因的 特异位点上，构成工程化胚胎干细胞，经过筛选鉴定， 体外增殖，最后输回小鼠胚胎胚泡中，形成转基因动 物，在这种方法中，整合的随机性可以避免。
绝大多数的ES细胞不能整合DNA，采用正负选择 方法可将整合在特异位点上的转基因ES细胞选出，并 在体外富集这种细胞。
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（二）DNA显微注射法
I 基本程序： 1) 通过激素疗法使田鼠超数排卵，48小时后再注
射人绒毛膜促进腺激素，这时田鼠便会超数排卵，一 般情况下5-10个，超数排卵为35个。
2) 与雌性小鼠交配，然后杀掉田鼠，从其输卵管 内取出受精卵。
3) 将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变 大的雄性原核内。
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I 转基因选择载体的构建 转基因选择载体通常包括下列部分：
1) 两个同源DNA片段（HB1,HB2），它们与ES 细胞中某一必需基因两端同源，保证转基因及标记基 因neor通过同源交换定向整合在ES的这一非必需基因 内部。
2) 转基因（TG），必须能赋予受体ES细胞新 的功能。
4) 将25-40个注射转基因的受精卵移植入田鼠体内。 5) 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代
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6) 从小鼠子代体内提取DNA样品，杂交鉴定转基因的 整合与否及位点。
7) 子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗 传及表达
II 优缺点： 1) 优点：转基因范围广，且可转移较大DNA片
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I 共抑制效应的特征 i 共抑制只发生在转基因与同源基因之间，而不
影响其它基因的表达。 ii 转基因与内源基因发生体内重组后，共抑制
效应消失，基因表达恢复正常。 iii 共抑制现象的发生与结构编码区有关，而与
启动子的来源无关。 iv 两个相同的转基因之间也发生共抑制效应，
这也许是转基因动植物中单拷贝的转基因通常具有最 高表达率的原因。
II 共抑制效应的产生机制假说 i 转基因与同源基因相互作用，形成某种后成状
态而影响两者的表达
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ii 转基因与内源基因因竞争性结合核基质，核包 膜上转录翻译必须的不扩散元件而出现相互抑制。
iii 两者形成互为反义RNA，使之失活并快速降 解。
2） 单链DNA体外合成：根据靶基因顺序，体外 设计并合成一小段DNA单链（反义DNA），它与靶基 因mRNA5'端的翻译起始区互补，并抑制其翻译。然 后将高浓度的单链反义DNA片段直接加入细胞培养基 中，由于这种反义DNA分子量小，细胞会以较低的频 率吸收。如果将这些反义DNA进行一些化学修饰，那 么共转化效率和胞内的稳定性均会大幅度提高。
iv 由于外源基因的存在，mRNA大量积累，并 激活某些未知酶素，导致mRNA降解。
III 转基因失活的可能原因：有时，转基因单方面 失活，其同源的内源基因仍表达。
i 转基因被受体细胞识别为异己DNA，并将之甲 基化修饰，使其失活。
ii 转基因整合在不合适的染色体部位，受局部 区域的影响而不表达。
iii 转基因本身的结构对其表达的影响因素，如 调控元件，内含子结构的存在与否等等。
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第三节 动物基因工程应用
• 动物基因工程的应用主要体现在以下三个方面： a. 研究基因的表达与功能 b. 改良物种（牛、鼠、羊、猪、鸡、鱼） c. 作为生物反应器生产重组蛋白，主要是医药。在
人类中，基因工程的主要用途是基因治疗。 一、利用动物转基因技术研究基因的表达与功能
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• 2.腺病毒（Adenovirus） 线状双链DNA，36kb,包装上限37.8kb, 修饰后上限4kb。 3.牛痘病毒 185kb，操作困难, 先以重组病毒感染细胞，使其大量 表达T7 RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启
动子的细菌重组质粒以脂质体的方式导入细胞。经过 一段时间预培养，外源基因即在T7 RNA聚合酶作用下 转录并翻译出异源蛋白。
段，可达数百kb；转基因不含任何病毒基因组片段， 绝对安全。
2) 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合， 多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成 转动物基因组的重排、突变、易位缺失等。
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三、工程胚胎干细胞法
多效性胚胎干细胞（ES）：胚胎发育到卵泡阶段的 细胞能在培养基中体外扩增，重新输入到胚胎胚泡后， 仍保留分化成其他细胞的能力。
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一般的，显微注射可达几kb-250kb；酵母人工染色体 （YAC)转基因至胚胎干细胞可达670kb；病毒为载体 可转移的片段一般不超过20kb。 （二）转基因的共抑制效应（Co-suppression） 在转基因动物的研究中，转基因的表达特性常会 出现许多出人意料又难以解释的现象。其中最普遍的 现象便是转基因的失活，也称为转基因的沉默，这种 现象在转基因动植物中均有发生。迄今为止，转基因 的失活现象在转基因植物中研究得较深入。研究表明， 转基因的失活机制是转基因与内源基因（同源基因） 的共抑制效应，即当受体细胞基因组中含有转基因的 同源基因时，转基因与内源基因的表达同时受到抑制.
3） 反义RNA的体内表达载体构建：构建原理是 将靶基因反向接在一个强启动子的下游，
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• 将这一反义RNA分子，并以绝对的浓度优势，与细胞 内靶基因mRNA结合，这些双链杂交分子不久便被 RNase水解掉。 c. 利用报告基因探测调控序列
• 二、改良动物遗传性状 将抗病毒基因或编码优良性状的基因转入动物受
• 转基因技术在基因研究中的应用，大致有三种情况： a. 同源重组灭活细胞内源基因 转基因进入动物细胞内后，通常会发生随机整合，
这不能灭活内源同源基因。但当转基因与细胞内基因 组中某区域具有高度同源性时，转基因便能准确地与 基因组中的同源重组。但在高等哺乳类动物体内则十 分罕见，其同源重组频率只及随机整合的千分之一。 然而，如果在转基因结构中，携带一个灵敏的标记基 因，便能有效地区分同源重组与随机整合，筛选出所 期望的细胞株，并将之输回雌性动物的胚胎中。在其 子代体内观察转基因的表型。
4.逆转录病毒 整合型单链RNA病毒，装配大小8kb。感染后，由逆 转录酶作用下，形成双链DNA，插入寄主基因组复制， 转录成mRNA，装配分泌到胞外，不造成宿主细胞死 亡。
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5. pBR322和BVP分子的穿梭载体 在动物基因工程中，经常使用启动子有以下几种： 热休克基因家族启动子pHS（热休克因子诱导） 病毒长末端重复序列启动子（糖皮质激素） 金属硫蛋白基因启动子（重金属诱导）
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第二节 动物基因基因转移的方法
• 一、动物基因工程的载体 动物基因工程的载体主要有以下几种： １.猿病毒（SV40） 双链环状DNA，5226bp
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SV40的结构
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3) 通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 系（通常是小鼠细胞系）
采用的方法包含：磷酸钙沉淀法，DNA+磷酸缓 冲+CaCL2电穿孔法，脂质体包埋法 4) 重组DNA分子转录出RNA重组分子，包装细 胞合成包装蛋白包装成熟颗粒。
5) 收集逆转录重组病毒，感染8细胞阶段的小鼠 胚胎细胞。
6) 利用标记基因筛选整合型转基因胚胎细胞。 7) 移植入小鼠母体体内。