尖吻蝮(Deinagkistrodon-acutus)蛇毒中抑制回肠平滑肌收缩的蛋白组分(DA-1)

尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒中抑制回肠平滑肌收缩的蛋白组分(DA-1)的分离纯化及其生化与药理研究尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)又称五步蛇,为蝰蛇科蝮亚科毒蛇,是我国十大毒蛇之一,主要分布于我国南方地区。

被该蛇咬伤的患者,常出现疼痛、出血、肿胀、肌肉坏死等血循毒症状,也有少数患者出现眼睑下垂、呼吸困难等神经毒症状,这暗示着尖吻蝮蛇毒中可能含有神经毒素,但是,有关该蛇的这类神经毒性的毒理学活性、结构与功能的关系以及作用机理等尚不清楚。

到目前为止,只见锯鳞蝰(Echis carinatus)蛇毒能抑制回肠平滑肌收缩的报道。

本研究首先确定尖吻蝮蛇毒是否具有抑制回肠收缩的活性,再从粗毒中分离纯化出具有该活性的目标蛋白组分,最后鉴定该蛋白的理化性质、生物学活性及药理活性等。

通过三步柱层析法(Sephadex G-50凝胶过滤层析,DEAESepharose Fast Flow 离子交换层析和Hitrap Capto DEAE离子交换层析),从尖吻蝮蛇毒中分离纯化出一种能抑制回肠平滑肌收缩的类神经毒性蛋白。

还原性和非还原性SDS-PAGE均检测为单一泳带,显示该蛋白是由单一肽链组成,命名为DA-1。

MALDI-TOF-TOF质谱测得其相对分子量为22,947.9 Da。

肽质量指纹图谱数据表明与其匹配度最高的蛋白为蛇毒金属蛋白酶。

生化实验表明,DA-1可明显水解牛纤维蛋白原的Aα-和Bβ-链,但对γ-链无作用,且DA-1也可水解纤维蛋白单体。

其纤维蛋白原水解活性可被金属螯合剂
EGTA或EDTA完全抑制、β-巯基乙醇部分抑制,而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对
水解活性无影响。

小鼠背部皮下注射DA-1发现该蛋白具有明显的出血活性。

以上这些实验结果提示DA-1为一种出血性的金属蛋白酶。

其他生化实验结果表明,该酶具有促水肿活性和磷脂酶A2(PLA2)活性,而无
溶血活性。

DA-1能抑制小鼠回肠平滑肌自发性收缩,并呈一定的量效和时效关系。

在高剂量(12μg/ml)下,肌肉收缩幅度在22分钟时达到90%抑制率;同时,随着DA-1的剂量降低,肌肉收缩的抑制率也随着降低;实验证明即使是在高剂量(12μg/ml)下与回肠标本孵育60分钟,DA-1对小鼠回肠平滑肌的收缩频率亦没
有影响。

但是,在60分钟后对各个浓度作用的肌肉标本进行清洗,收缩幅度都无法得到恢复,说明DA-1的作用方式是不可逆的。

DA-1可以抑制由外源性激动剂Ach和KCl引起的痉挛性收缩,且有剂量依赖性。

PLA2抑制剂4-BPB与DA-1在30℃孵育24小时,其孵育混合物同样能使回肠平滑肌收缩抑制,说明DA-1的PLA2活性与该蛋白抑制回肠平滑肌收缩的作用不相关联。

综上所述,本文分离纯化的蛇毒抑制蛋白(DA-1)为一种出血性的金属蛋白酶,能剂量依赖性地抑制小鼠回肠平滑肌的自发性和痉挛性收缩,其抑制效果不可逆;不仅具有纤维蛋白原水解活性和出血活性,而且具有PLA2活性和促水肿活性,但无溶血活性。

磷脂酶活性抑制实验证明,该蛋白组分的药理活性与PLA2活性无关。

平滑肌收缩幅度的降低可能是由出血性的金属蛋白酶不可逆地破坏肌细胞
或神经细胞的完整性引起的,这方面的详细作用机制有待进一步研究。