PCR 技术及其在动物学研究中的应用

PCR 技术及其在动物学研究中的应用
王海峰　罗玉钏
(广东省昆虫研究所,广州　510260)
多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR),是近年来发展起来的一种先进的特定DN A 片段体外扩增技术。

关于PCR 的首次报道是在1985年,Saiki 等用此技术进行胎儿镰刀状贫血基因的产前诊断。

1988年,Saiki 等从温泉水中1株水生嗜热杆菌(Thermus a qua ticus )中提取出在95℃高温环境中仍具有良好热稳定性的TaqDN A 聚合酶,从此PCR 技术开始进入实用阶段,并以其简便、快速、高敏感度等特性而在基础研究、生物工程、监床诊断、遗传研究等领域得到广泛应用。

1　PCR 基本原理和进展
PCR 反应体系主要包括含待扩增的特定区段的模板DN A,1对短的引物(Primer),
4种dN T P ,PaqDN A 聚合酶,Mg 2+,K +和Tris -HCl 缓冲液等。

反应过程主要有3个阶
段:①　高温变性:加热使DN A 双键断裂,形成游离的单链DN A ,成为下一步反应的模
板。

解链温度一般在85～95℃之间;②　引物退火:系统温度降为52～55℃左右时,高
浓度的引物竞争性地与模板DN A 形成局部双链,成为DN A 复制的起点;③　
中温延伸:当体系温度升至60～72℃时,TaqDN A 聚合酶催化引物延伸形成单拷贝基因。

这样每经过一次循环,模板DN A 的数量便加倍,若PCR 扩增循环30次,则模板DN A 的数量理论上便达到230之多!这种放大效应也正是PCR 技术具有高灵敏度的原因。

RN A 的PCR 扩增则包括:①　在逆转录酶的催化下,单一引物引导合成cDN A ;②　cDN A 与另一引物互补并合成双链DN A ;③　对该双链DN A 进行扩增。

检测PCR 扩增产物常用的方法有琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶片段分析、核酸杂交和序列分析等方法。

正确扩增DN A 特定区段的关键是人工合成的一对寡核苷酸引物。

引物位于DN A 特定区段的两端,分别处于互补的DN A 链3′端,故引物向5′端方向延伸。

引物的长度影响扩增产物的特异性,一般为20个碱基左右的脱氧寡核苷酸并且典型的PCR 引物内应含50%G +T,没有自身互补序列,且注意3′未端不应有内部二级结构。

在反应中要合理控制引物和模板的浓度比例,防止形成引物二聚体。

近年来,PCR 技术在应用中不断得到发展和进步。

在研究病毒整合位点及与肿瘤相关性的过程中发展了反向PCR 技术,即用限制性内切酶酶解DN A,然后用连接酶使带有粘性未端DN A 特定区段自身环化,最后用一对反向的互补引物来扩增两引物以外的DN A
收稿日期6　
1997年第1期中山大学学报论丛SUP PLEM EN T TO T HE J OU RN AL OF SUN YATSEN UNIVER SI TY No.11997
:199-11-01
片段。

如C 型反转录病毒—长臂猿白血病病毒在瘤细胞U CD 144MLA 上的整合位点的分析研究。

LP —PCR 技术利用同位素、荧光染料等标记引物的5′端,扩增后经电泳或离心沉淀,可以很直观的判断目标基因是否存在,该方法多用于基因缺失、染色体易位或感染某种病毒的大量标本的临床定性诊断。

Z eeland 在检测HPRT 基因外显子的点突变的工作中,采用了不对称PCR 技术,即用浓度比约为1∶50的非等量的一对引物扩增产生大量ssDN A 的方法。

该方法主要是为DN A 序列分析制备单链DN A 。

套嵌(Nested)PCR 技术可以扩增未知序列的DN A 片断,只需知道载体或受体的序列即可。

Sohlayer (1992)等用此方法检查了变异毒株非保守区域的DN A 序列。

近年来,在连接酶检测反应(L igase Detection Reaction,LDR)的基础上,引入具热稳定性连接酶而建立起类似PCR 技术的连接酶链反应(Ligase Chain Reaction,LCR)技术。

该方法对于已知基因突变类型的疾病诊断是一个有效的方法,特别适合大量样本普查与筛选。

2　PCR 在动物学研究中的应用举例
哺乳动物的性别由性染色体决定,利用扩增Y 染色体特异片段的引物,对检测标本进行扩增后检验,如果出现Y 染色体特异性片段,说明为雄性,否则为雌性。

陈美珏等(1996)在对山羊Y 染色体性别决定区(SRY)序列分析的基础上,设计出特异于SRY 的引物,应用PCR 扩增Y 染色体性别决定区序列鉴定山羊胚胎性别。

乙型肝炎是人畜共患的一种疾病,由HB V 引起。

目前常规方法是利用免疫学原理进行检测,反向血凝法和酶联免疫吸附试验法(ELISA)利用抗原一抗体反应间接检测血清中是否存在HBV,敏感度为0.1mg /L,而PCR 技术直接检测血清中是否存在HB V -DN A,灵敏度可达到2mg /L 水平,故可以大大降低ELISA 的方法产生的漏检率。

乙肝病毒(HBV )扩增片段区S ,preS 及CX 区120～620,38～550。

王川庆等人利用对人类HBV-DN A 特异性的引物扩增经ELISA 方法检出为阳性的猪、牛血清,未发现特异性DN A 片段,即无对人具感染性的HBV 粒子存在。

这说明牛、猪等家畜在HBV 的传播上不会对人类造成威胁。

鸡传染性法氏囊病(IBD )是传染性法氏囊病毒(IBDV )引起鸡的1种急性传染病。

该病毒为双股RN A 病毒,有两个血清型,并可分为许多亚型。

IBD 不仅能引起3周龄以上雏鸡20%～30%的死亡率,而且可导致感染雏鸡特别是3周龄以下雏鸡的免疫抑制,故早期诊断非常重要。

原有的琼脂扩散法、中和试验、ELISA 均不适合于早期诊断,应用反转录多聚酶链反应(RT —PCR)技术扩增IBDV 核酸高度保守的Vp4编码区中150bp 的片段,然后2%琼脂糖凝胶电泳分析,出现了DN A 扩增带,而同时进行的新城疫病毒(NDV )、马立克氏病毒(MDV )、禽呼肠孤病毒(REOV )、Vero 细胞、SPF 鸡法氏囊组织均未出现扩增带。

这说明PCR 的方法具有快速、灵敏和高特异性特点。

支原体是一类常居于家畜和禽类呼吸道或泌尿生殖道的原核细胞型微生物,个体微小、无细胞壁、具有多形性。

目前支原体检测方法有体外培养、免疫荧光抗体、间接血凝法、LIS 和R 技术等。

支原体体外培养要求高、生长缓慢、易造成污染且检出阳性率低。

目前已知的支原体有5多种,许多支原体存在共同抗原导致免疫学方法经常出现假阳性或假阴性反应。

B ()从肺炎支原体(My )基因124中山大学学报论丛1997年E A PC 0ernet 1989coplasma pneumonia
文库中获取了特异性DN A 片段,测序后设计出1对引物和1个寡聚核苷酸探针,建立了PCR 检测肺炎支原体的方法。

Nascimento 从鸡败血支原体(MG)基因文库中获取了760bp 的BamH Ⅰ-EcoR ⅠDN A 特异性片段,根据该片段合成了25个碱基长度的引物后进行PCR 扩增,经溴化乙锭紫外曝光测出扩增产物,而其它16种支原体的对照实验未检出扩增产物。

这为减少养禽业的损失,提供了一种快速、特异、敏感和简便的检测方法。

PCR 技术的发展使人们能够从毛发、兽皮等标本中迅速获取大量有用的遗传信息,如对线粒体DN A(母系遗传的生物大分子)控制区段进行PCR 扩增后序列分析的方法已成为当今研究物种内遗传多样性及种上系统分类关系的有力工具,宿兵等采用非损伤性DN A 基因分型技术(Noninvasive DN A genotyping)对黑冠长臂猿11个个体的线粒体DN A 控制区中的约200bp 的片断,经PCR 扩增后进行序列分析,证实了中国黑冠长臂猿3个新亚种等等。

张亚平运用此技术测定了亚洲黑熊线粒体细胞色素b 基因片段的DN A 序列,这种非损伤性方法不需要损伤基至捕杀动物,避免了传统的蛋白质电泳、DN A 限制性片段长度多态及DN A 序列分析等方法的局限性。

PCR 方法的其它应用也有许多报道,如Wa ng Y ibing 运用PCR 技术监测猴血液中的D 型逆转录病毒,Weigler Benjamin J 运用RAPD -PCR (Ra ndomly Ampified Poly-morphic DN A Polymerase Chain Reation )方法对感染实验小鼠Pasteurella pneumotropi-ca 菌进行分子流行病学监测。

王义权等运用RAPD-PCR 技术,以10个碱基长度的寡聚核苷酸链为引物,检测了乌梢蛇等6种蛇的基因组DN A 的多态性,证实该方法分析所得的结果与染色体、颅骨和半阴茎研究的结果基本一致。

3　结　语
PCR 技术用于实验室研究和诊断,只需要极少量的样品(如1个精子或1个发囊的基因分析),对样品质量要求不高无论细胞或体液、粗提或纯化RN A /DN A 均可,具有高灵敏度、特异性强、简便、快捷的特点,而且加之以各种PCR 扩增仪的推广使用,相信PCR 技术在基因的检测等方面会得到更广泛应用。

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