鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定

㊀南京农业大学学报㊀２０２１ꎬ４４(２):３５３－３５８ｈｔｔｐ://ｎａｕｘｂ.ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ㊀ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤＯＩ:１０.７６８５/ｊｎａｕ.２０２００３００５收稿日期:２０２０－０３－０３
基金项目:国家自然科学基金项目(３１７７２６４８ꎬ３２０７２７８１)ꎻ国家重点研发计划项目(２０１６ＹＦＤ０５００５０５)
作者简介:郗蒙雪ꎬ硕士研究生ꎮ∗通信作者:李春梅ꎬ教授ꎬ博导ꎬ主要从事动物环境生理与营养研究ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｃｈｕｎｍｅｉｌｉ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
郗蒙雪ꎬ戴鹏远ꎬ沈丹ꎬ等.鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定[Ｊ].南京农业大学学报ꎬ２０２１ꎬ４４(２):３５３－３５８.
ＸＩＭｅｎｇｘｕｅꎬＤＡＩＰｅｎｇｙｕａｎꎬＳＨＥＮＤａｎꎬｅｔａｌ.ＩｓｏｌａｔｉｏｎꎬｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙａｌｖｅｏｌａｒｔｙｐｅⅡｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０２１ꎬ４４(２):３５３－３５８.
鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定
郗蒙雪ꎬ戴鹏远ꎬ沈丹ꎬ李春梅∗
(南京农业大学动物科技学院/南京农业大学家畜环境控制与智慧生产研究中心ꎬ江苏南京２１００９５)
摘要:[目的]本试验旨在建立一套稳定的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞分离㊁纯化和培养技术ꎬ为深入研究鸡舍空气污染物对鸡肺泡功能影响提供体外研究模型ꎮ[方法]采用Ⅰ型胶原酶对１６日龄鸡胚的肺组织进行消化ꎬ经过差速离心和差速贴壁法分离细胞ꎬ采用鸡免疫球蛋白Ｇ(ＩｇＧ)免疫吸附法纯化细胞ꎬ再利用免疫荧光检测和碱性磷酸酶进行细胞鉴定ꎮ[结果]培养
１８~２４ｈ细胞伸展贴壁ꎬ细胞为多边形ꎬ呈岛屿状生长ꎻ培养２４~７２ｈꎬ细胞增殖代谢旺盛ꎬ胞核明显ꎬ胞浆丰富ꎬ细胞之间逐渐连接成单层ꎻ培养７２ｈ后ꎬ细胞内颗粒物减少ꎬ细胞形态改变ꎮ免疫荧光检测可见上皮细胞标志物细胞角蛋白１９(ｃｙｔｏｋ￣ｅｒａｔｉｎ￣１９ꎬＣＫ１９)的表达ꎬ碱性磷酸酶染色可见胞浆内出现弥散的红色或红棕色颗粒物ꎮ[结论]该方法是一种有效的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞分离㊁纯化和培养的技术ꎬ细胞产量高ꎬ纯度大ꎬ能够满足一般的体外研究ꎮ
关键词:肺泡Ⅱ型上皮细胞ꎻ原代细胞培养ꎻ分离ꎻ鉴定ꎻ鸡胚
中图分类号:Ｓ８３１.１㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１０００－２０３０(２０２１)０２－０３５３－０６ＩｓｏｌａｔｉｏｎꎬｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙａｌｖｅｏｌａｒｔｙｐｅⅡ
ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏ
ＸＩＭｅｎｇｘｕｅꎬＤＡＩＰｅｎｇｙｕａｎꎬＳＨＥＮＤａｎꎬＬＩＣｈｕｎｍｅｉ∗(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ/ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＬｉｖｅｓｔｏｃｋＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＳｍａｒｔＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎬＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００９５ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:[Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ]ＴｈｅａｉｍｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｓｔａｂｌｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎꎬｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｃｈｉｃｋｅｎｔｙｐｅⅡａｌｖｅｏｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓꎬａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｎｉｎｖｉｔｒｏｒｅｓｅａｒｃｈｍｏｄｅｌｆｏｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｉｒｐｏｌｌｕｔａｎｔｓａｎｄｏｔｈｅｒｅｎｖｉ￣ｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓｆａｃｔｏｒｓｏｎｃｈｉｃｋｅｎａｌｖｅｏｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ.[Ｍｅｔｈｏｄｓ]Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｆｒｏｍ１６￣ｄａｙ￣ｏｌｄｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｓｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｗｉｔｈｔｙｐｅⅠｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ.ＡｆｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎꎬａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｔｔａｃｈｍｅｎｔꎬｃｈｉｃｋｅｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ(ＩｇＧ)ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄꎬａｎｄｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｃｅｌｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ.[Ｒｅｓｕｌｔｓ]Ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅａｄｈｅｒｅｄｆｏｒ１８－２４ｈꎬａｎｄｔｈｅｙｗｅｒｅｐｏｌｙｇｏｎａｌｉｎｓｈａｐｅａｎｄｇｒｅｗｌｉｋｅｉｓｌａｎｄｓ.Ａｆｔｅｒ２４－７２ｈꎬｔｈｅｃｅｌｌｓｈａｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄｖｉｇｏｒｏｕｓｌｙꎬｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓｗａｓｏｂｖｉｏｕｓꎬｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｗａｓｒｉｃｈꎬａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｓｇｒａｄｕａｌｌｙｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｆｏｒｍａｍｏｎｏｌａｙｅｒ.Ａｆｔｅｒ７２ｈꎬｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｍａｔｔｅｒｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｃｈａｎｇｅｄ.Ｉｍｍｕｎｏ￣ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｍａｒｋｅｒｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ￣１９(ＣＫ１９).Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｄｉｆｆｕｓｅｒｅｄｏｒｒｅｄ￣ｂｒｏｗｎｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ.[Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ]Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎꎬｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｃｈｉｃｋｅｎａｌｖｅｏｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｗｉｔｈｈｉｇｈｃｅｌｌｙｉｅｌｄａｎｄｐｕｒｉｔｙꎬｗｈｉｃｈｃａｎｓａｔｉｓｆｙｇｅｎｅｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｖｉｔｒｏ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｔｙｐｅⅡａｌｖｅｏｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓꎻｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅꎻｉｓｏｌａｔｉｏｎꎻｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏ集约化畜禽养殖生产过程中可产生大量的颗粒物(ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｍａｔｔｅｒꎬＰＭ)㊁氨气(ＮＨ３)㊁硫化氢(Ｈ２Ｓ)等空气污染物ꎬ它们能够通过呼吸进入肺泡ꎬ增加患呼吸系统疾病风险ꎬ危害畜禽健康[１]ꎮ柏仕均等[２]研究报道ꎬ鸡舍空气粉尘污染致鸡出现呼吸道黏膜干燥㊁萎缩等症状ꎮ申慧敏等[３]发现ꎬ鸡舍中ＮＨ３㊁Ｈ２Ｓ等有害气体容易通过鼻腔进入呼吸道ꎬ造成呼吸困难㊁气管炎和支气管炎㊁肺水肿㊁呼吸机能紊乱等现象ꎬ严重危害鸡的机体健康和生产性能ꎮ肺泡Ⅱ型上皮细胞(ｔｙｐｅⅡａｌｖｅｏｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓꎬＡＥＣⅡ)是肺泡内重要的功能和结构细胞[４]ꎮＡＥＣⅡ细胞能够分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞ꎬ具有无限增殖能力ꎬ促进肺泡上皮细胞再生与修复ꎬ维持上皮细胞的完整性[５]ꎮＡＥＣⅡ细胞还具有肺水转运功能ꎬ可消除肺水肿[６]ꎮＡＥＣⅡ细胞还可以分泌表面活性物质ꎬ抵御病原体的入侵[７]ꎮ除此之外ꎬ它还能够分泌一些抗炎㊁抗菌物质ꎬ提高
４５３
南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４４卷免疫功能[８－９]ꎮ因此ꎬＡＥＣⅡ细胞是多种肺部疾病发病的攻击靶点[１０－１１]ꎬ已有大量研究表明ꎬ许多肺部疾病的发生与发展伴有ＡＥＣⅡ细胞的损伤ꎬ甚至是死亡[１２－１３]ꎮ因此ꎬ在有关鸡舍空气污染物对鸡肺泡功能及肺部炎症损伤的研究中ꎬ鸡的ＡＥＣⅡ细胞是非常重要的体外细胞模型ꎮ尽管目前国内外已有大量对大鼠㊁小鼠㊁牛等[１４]的ＡＥＣⅡ细胞分离培养方法的相关报道ꎬ但是在禽类的研究较少ꎮ有试验表明ꎬＡＥＣⅡ细胞在培养过程中贴壁速度慢ꎬ不易增殖分裂ꎬ不易传代[１５]ꎬ而且随着培养时间的延长ꎬ细胞形态和功能逐步丧失[１６]ꎬ因此目前尚未有鸡ＡＥＣⅡ细胞株ꎬ这也限制了开展有关鸡ＡＥＣⅡ细胞的相关研究[１７]ꎮ鉴于此ꎬ建立一套稳定的鸡ＡＥＣⅡ细胞的分离培养方法十分重要ꎮ本试验拟采用１６日龄的鸡胚ꎬ用Ⅰ型胶原酶对其进行消化ꎬ经差速离心㊁差速贴壁以及免疫吸附ꎬ以建立一套稳定的鸡胚原代ＡＥＣⅡ细胞分离㊁纯化和培养技术ꎬ为进一步研究鸡ＡＥＣⅡ细胞的生物学特性及鸡舍空气环境应激因素对鸡肺泡功能及肺部炎症损伤研究提供体外细胞研究模型ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀材料
１.１.１㊀试验动物㊀１６日龄ＳＰＦ鸡胚ꎬ购自江苏省南京市特有机有限责任公司ꎮ
１.１.２㊀主要试剂与仪器㊀ＤＭＥＭ培养基㊁胎牛血清(ＦＢＳ)购自ＢＩ公司ꎻＤ￣Ｈａｎｋ ｓ液㊁鸡免疫球蛋白Ｇ(ＩｇＧ)㊁碱性磷酸酶染色试剂(偶氮偶联法)盒购自南京建成生物技术有限公司ꎻⅠ型胶原酶购自鼎思生物科技有限公司ꎻ细胞角蛋白１９(ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ￣１９ꎬＣＫ１９)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司ꎮ倒置显微镜(上海光学仪器一厂)ꎮ
１.２㊀试验方法
１.２.１㊀鸡ＡＥＣⅡ细胞的分离㊀取１６日龄ＳＰＦ鸡胚ꎬ用体积分数为７５％的乙醇消毒ꎮ在无菌条件下ꎬ用眼科镊子钝端轻轻击碎胚蛋气室ꎬ剥开壳膜ꎬ将鸡胚取出放入超净台ꎮ斩首剖胸后ꎬ轻轻将双肺移至装有Ｄ￣Ｈａｎｋ ｓ液的青霉素瓶中ꎬ用无菌眼科剪将其剪成约１ｍｍ３的小块并剔除气管㊁支气管以及血管等非肺组织ꎬ不断清洗直至液体清亮ꎮ去除洗液后ꎬ加入经３７ħ预温㊁体积分数为０.１％的Ⅰ型胶原酶(每只鸡胚约０.１~０.１２ｍＬ)ꎬ转移至３７ħ恒温振荡水浴锅中ꎬ振荡消化１５~２５ｍｉｎꎮ待消化液颜色清亮ꎬ用等量含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ终止消化ꎬ依次用１５０μｍ㊁７６μｍ筛网过滤后ꎬ１０００ｒ ｍｉｎ－１低温离心５ｍｉｎꎬ收集细胞沉淀ꎮ
１.２.２㊀鸡ＡＥＣⅡ细胞的纯化与培养㊀１)鸡ＩｇＧ包被培养皿ꎮ用Ｄ￣Ｈａｎｋ ｓ液配制１ｍｇ ｍＬ－１鸡ＩｇＧ溶液ꎬ将其按照０.１５~０.２０ｍｇ ｃｍ－２铺于培养皿中ꎬ轻轻摇晃ꎬ使其完全覆盖培养皿底部ꎻ将培养皿移至３７ħ㊁５％ＣＯ２的培养箱中孵育５~６ｈꎬ吸弃鸡ＩｇＧ溶液ꎬ用适量磷酸盐缓冲液(ＰＢＳ)冲洗培养皿２~３次ꎬ备用ꎮ２)纯化细胞ꎮ用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ重悬细胞沉淀ꎬ将其接种于不经特殊处理的细胞培养皿中ꎬ置于３７ħ㊁５％ＣＯ２的培养箱中孵育１ｈꎬ大部分成纤维细胞将会贴壁ꎬ轻轻吸取培养液于离心管中ꎬ８００ｒ ｍｉｎ－１低温离心１０ｍｉｎꎮ离心后ꎬ弃上清液ꎬ用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ重悬细胞沉淀ꎬ继续在培养箱中培养１ｈꎬ重复２~３次ꎬ去除成纤维细胞ꎮ吸出未贴壁的细胞ꎬ将其接种于用鸡ＩｇＧ包被的培养皿中ꎬ在３７ħ㊁５％ＣＯ２的培养箱中孵育１ｈꎬ以去除巨噬细胞ꎮ收集培养液于离心管中ꎬ８００ｒ ｍｉｎ－１低温离心１０ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ用含２０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ重悬细胞沉淀ꎬ用３８μｍ筛网过滤ꎬ去除Ⅰ型上皮细胞ꎮ将分离纯化的细胞密度调整为(１.５~２.０)ˑ１０６ｍＬ－１ꎬ接种于细胞培养瓶中ꎬ在３７ħ㊁５％ＣＯ２的培养箱中孵育１５~１８ｈ后ꎬ弃去培养液ꎬ用含２０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ继续培养ꎮ每２~３ｄ更换１次培养液ꎬ注意观察细胞形态变化ꎮ３)台盼蓝染色检测细胞活力ꎮ制备体积分数为０.４％的台盼蓝染液ꎬ取１００μＬ纯化后的细胞悬液与等体积的０.４％台盼蓝染液混合ꎬ取１０μＬ滴入到红细胞计数板上ꎮ镜下观察ꎬ死细胞被染成明显的蓝色ꎬ活细胞不被染色ꎬ呈无色透明状ꎬ在３ｍｉｎ内分别对活细胞和死细胞进行计数ꎬ计算细胞活力ꎮ
１.２.３㊀鸡ＡＥＣⅡ细胞的鉴定㊀１)免疫荧光染色鉴定ꎮ将细胞接种于放有盖玻片的六孔板中ꎬ培养３６~４８ｈ后ꎬ每孔加入１ｍＬ含４％的多聚甲醛ꎬ室温固定１ｈ后ꎬ在０.５％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００中通透１０ｍｉｎꎬＰＢＳ清洗３次后ꎬ用含１％牛血清白蛋白(ＢＳＡ)的ＰＢＳ室温封闭１ｈꎬＣＫ１９一抗１ʒ１００稀释ꎬ３７ħ避光孵育１ｈꎬ用ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照染色ꎮ用ＡｌｅｘａＦｌｕｏｘ４８８标记的二抗(１ʒ２００)３７ħ避光孵育１ｈꎬＰＢＳ清洗３次后加入３μｇ ｍＬ－１４ᶄꎬ６－二脒基－２－苯基吲哚(ＤＡＰＩ)避光孵育１０ｍｉｎꎬ滴加抗淬灭剂ꎬ封片ꎬ激光共聚焦显微镜下观察ꎮ２)碱性磷酸酶染色鉴定ꎮ制作细胞爬片ꎬ２４ｈ后用固定液固定３ｍｉｎ左右ꎬ按照碱性磷酸酶染
㊀第２期郗蒙雪ꎬ等:鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定液试剂盒提供的方法配制底物应用液ꎬ将底物应用液滴加到细胞爬片上ꎬ３７ħ避光孵育１５ｍｉｎꎮ同时ꎬ用ＰＢＳ代替底物应用液制作阴性对照ꎮ孵育完成后ꎬ水洗２ｍｉｎꎬ用复染液复染３０ｓꎬ蒸馏水洗１ｍｉｎ左右ꎬ甩干ꎬ镜检ꎮ
１.３㊀数据分析
应用Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍ６.０软件进行数据分析ꎬ试验数据以平均数ʃ标准差( ｘʃＳＤ)表示ꎮ２㊀结果与分析
２.１㊀鸡ＡＥＣⅡ细胞的产量㊁纯度和活力表１㊀鸡ＡＥＣⅡ细胞的产量㊁纯度和活力(ｎ＝５)Ｔａｂｌｅ１㊀ＹｉｅｌｄꎬｐｕｒｉｔｙａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｈｉｃｋｅｎＡＥＣⅡｃｅｌｌｓ每胚细胞产量/１０７Ｃｅｌｌｙｉｅｌｄｐｅｒｅｍｂｒｙｏ细胞纯度/％Ｃｅｌｌｐｕｒｉｔｙ细胞活力/％Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ１.７５ʃ０.２５９４.３ʃ１.５９２.０ʃ１.２
㊀㊀本研究将１６日龄鸡胚肺组织消化分离ꎬ得到的细胞悬液再经过差速离心㊁差速贴壁㊁免疫吸附
纯化细胞后ꎬ最终每个鸡胚获得的鸡ＡＥＣⅡ细胞数
可达(１.７５ʃ０.２５)ˑ１０７ꎬ细胞纯度在９０％以上ꎬ细胞
活力为９２％左右(表１)ꎮ２.２㊀鸡ＡＥＣⅡ细胞的培养特性
如图１所示:１６日龄的鸡胚经过细胞提取㊁纯化培养后ꎬ约１８~２４ｈ时细胞伸展贴壁ꎬ呈多边形或立方形ꎬ胞内有大量细小颗粒ꎬ胞间紧密连接ꎬ形成岛屿状ꎻ培养２４~７２ｈꎬ细胞增殖代谢旺盛ꎬ胞核明显ꎬ胞浆丰富ꎬ细胞之间逐渐连接形成单层ꎻ培养７２ｈ后ꎬ细胞内细小颗粒有所减少ꎬ细胞形态逐渐变为扁平
ꎮ图１㊀倒置显微镜下原代培养不同时间的鸡ＡＥＣⅡ细胞(ˑ１００)
Ｆｉｇ １㊀ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｃｈｉｃｋｅｎＡＥＣⅡｃｅｌｌｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｕｎｄｅｒａｎｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ(ˑ１００
)图２㊀免疫荧光检测原代培养的鸡ＡＥＣⅡ细胞
Ｆｉｇ ２㊀ＣｈｉｃｋｅｎＡＥＣⅡｃｅｌｌｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
２.３㊀鸡ＡＥＣⅡ细胞的免疫荧光鉴定
如图２所示:ＣＫ１９是上皮细胞特有的标志蛋白ꎬ在ＣＫ１９＋(阳性)染色组中ꎬ细胞胞浆呈绿色荧光ꎬ即
ＣＫ１９染色呈阳性ꎬ细胞核被ＤＡＰＩ复染后呈现为蓝色ꎬ且大部分细胞为ＣＫ１９＋ＤＡＰＩ＋双阳性细胞ꎬ也有个别未呈现绿色荧光的细胞ꎻ而ＣＫ１９－(阴性)染色组中ꎬ细胞胞浆无着色ꎬ细胞核被ＤＡＰＩ复染后呈现为蓝色ꎮ５５３
南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４４卷２.４㊀鸡ＡＥＣⅡ细胞的碱性磷酸酶染色鉴定
如图３所示:细胞经碱性磷酸酶染色后ꎬ在倒置显微镜下观察ꎬ细胞核被染成深紫色ꎬ碱性磷酸酶活性部位呈弥散的红色或红棕色颗粒ꎬ定位于细胞浆ꎬ也有个别细胞胞浆未被染色ꎻ而在阴性对照组中ꎬ细胞核呈深紫色ꎬ胞浆未见着色
ꎮ
图３㊀原代培养鸡ＡＥＣⅡ细胞的碱性磷酸酶染色结果
Ｆｉｇ ３㊀ＣｈｉｃｋｅｎＡＥＣⅡｃｅｌｌｓｓｔａｉｎｅｄｂｙａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅ
３㊀讨论
目前ꎬ肺脏ＡＥＣⅡ细胞分离的方法主要包括全肺灌注消化法和肺组织块消化法[１８]ꎮ由于鸡肺比较小ꎬ不适宜采用全肺灌注消化法[１９]ꎬ因此本试验采用肺组织块消化法ꎮＡＥＣⅡ细胞分离时可选用多种消化酶ꎬ一般包括胰蛋白酶㊁弹性蛋白酶以及胶原酶[２０－２１]ꎮ胰蛋白酶价格便宜ꎬ适用范围广ꎬ但是易受ｐＨ值㊁温度㊁酶浓度等因素的影响ꎬ对细胞的损伤较大ꎮ弹性蛋白酶能够消化结缔组织中的弹性蛋白ꎬ消化效果好ꎬ几乎对细胞形态㊁活力㊁功能等无影响ꎬ但是其价格昂贵ꎬ不易获得[２２]ꎮ胶原酶能够很好地消化细胞间质ꎬ对细胞的损伤小ꎬ消化效果好[１９]ꎮⅣ型胶原酶对哺乳动物组织具有广谱消化作用ꎬ而Ⅰ型胶原酶主要用于消化肺㊁上皮等ꎮ本试验选用Ⅰ型胶原酶ꎬ在３７ħ条件下消化鸡胚肺组织２０ｍｉｎ左右可达到理想消化效果ꎬ与侯海燕等[１９]采用Ⅳ型胶原酶和胰酶相比ꎬ对细胞损伤小ꎬ消化效果好ꎬ步骤简单ꎬ易操作ꎮ鸡胚肺组织消化后所得的细胞悬液中有多种不同类型的细胞ꎬ因此需要进一步纯化ꎮ细胞纯化时常用的方法有差速离心㊁差速贴壁㊁流式细胞仪分选㊁密度梯度离心㊁免疫吸附等[２３－２５]ꎬ这些方法都有其各自的优缺点ꎮ本试验选用差速离心㊁差速贴壁以及免疫吸附相结合的方法进行细胞纯化ꎬ所得细胞纯度高㊁活力强ꎮ８００~１０００ｒ ｍｉｎ－１离心时ꎬ部分成纤维细胞因无法沉淀而滞留在上清液中ꎬ所以吸弃上清液可以去除部分成纤维细胞ꎮ因为成纤维细胞和ＡＥＣⅡ细胞贴壁时间不同ꎬ成纤维细胞贴壁时间约３０~４０ｍｉｎꎬＡＥＣⅡ细胞贴壁时间约１０~２０ｈꎬ经过２次贴壁ꎬ可有效去除成纤维细胞ꎮ细胞悬液中还有巨噬细胞㊁中性粒细胞㊁淋巴细胞等ꎬ这些细胞表面有ＩｇＧ的Ｆｃ受体ꎬ鸡ＩｇＧ能够与之结合ꎬ利用此特点进行免疫吸附纯化细胞[２６]ꎮ此时ꎬ所得细胞为鸡肺泡Ⅰ型上皮细胞(ＡＥＣⅠ)和鸡ＡＥＣⅡ细胞ꎬＡＥＣⅠ大小为５０~１００μｍꎬ经过３８μｍ筛网过滤后ꎬ即为纯化后的鸡ＡＥＣⅡ细胞ꎮ细胞骨架蛋白ＣＫ１９是上皮组织来源的特异性标志物ꎬ说明细胞具有上皮细胞的特质[２７－２８]ꎮ但是ꎬ肺
泡上皮细胞分为Ⅰ型上皮细胞和Ⅱ型上皮细胞[２９－３０]ꎮ为了进一步鉴定这些细胞为鸡ＡＥＣⅡ细胞ꎬ本试验选择碱性磷酸酶染色法ꎮ碱性磷酸酶可作为ＡＥＣⅡ细胞分化的标志ꎬ主要存在于细胞膜ꎮ采用碱性磷酸酶法染色后ꎬ成纤维细胞㊁巨噬细胞㊁淋巴细胞和其他细胞均为阴性ꎬＡＥＣⅡ细胞和中性粒细胞呈阳性ꎬ但是ꎬ中性粒细胞体积小ꎬ细胞核呈分叶状ꎬ明显区别于ＡＥＣⅡ细胞[１９ꎬ３１]ꎮ因此ꎬ免疫荧光检测和碱性磷酸酶染色相结合的方法ꎬ操作简单易行ꎬ并且确保鉴定的准确性ꎮ
综上所述ꎬ本试验利用１６日龄鸡胚的肺组织ꎬ采用Ⅰ型胶原酶进行消化ꎬ差速离心㊁差速贴壁和免疫吸附方法纯化细胞ꎬ并利用免疫荧光检测和碱性磷酸酶染色相结合的方法对细胞进行鉴定ꎬ最终获得稳６５３
７５３㊀第２期郗蒙雪ꎬ等:鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定
定㊁纯化的鸡ＡＥＣⅡ细胞ꎮ建立的鸡ＡＥＣⅡ细胞分离㊁纯化和培养体系ꎬ操作简单ꎬ易于推广ꎬ可满足一般试验需求ꎮ
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责任编辑:周广礼。