2 个玉米光敏色素C 基因的克隆及功能验证

河南农业科学,2021,50(1):16-26Journal of Henan Agricultural Sciences
doi :10.15933/ki.1004-3268.2021.01.003
收稿日期:2020-08-22
基金项目:国家自然科学基金项目(31871709);河南省技术创新引导专项(182106000050);北京市自然科学基金重点项目(6151002)作者简介:丁武思(1993-),男,河南巩义人,在读硕士研究生,研究方向:作物光信号转导㊂E -mail:dingwusi54@
陈士瞻为同等贡献作者
通信作者:杨建平(1965-),男,河南确山人,教授,博士,主要从事植物与作物发育生物学研究㊂E -mail:jpyang@
2个玉米光敏色素C 基因的克隆及功能验证
丁武思1,陈士瞻1,刘㊀磊1,樊晓聪1,丁梦月1,孙广华1,王立建1,2,杨建平1
(1.河南农业大学农学院,河南郑州450046;2.河南警察学院,河南郑州450046)
摘要:为了研究玉米与拟南芥光敏色素C (Phytochrome C ,PHYC )功能的异同,以及2个玉米
PHYC 基因在光形态建成和避荫性反应中的作用,克隆了玉米2个PHYC 基因,用生物信息学方法分析玉米PHYC 蛋白结构域,与常见物种PHYC 蛋白进行系统进化分析,并利用转基因技术在拟南芥中验证玉米PHYC 基因的功能㊂结果表明,从玉米B73自交系中克隆了ZmPHYC1和ZmPHYC2基因㊂它们的编码区长度为3405bp ,编码具有1135个氨基酸残基㊁分子质量为126.14ku
和126.07ku 的蛋白质㊂ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白结构域与拟南芥和水稻的PHYC 蛋白相似,
包含1个PAS_2结构域㊁1个GAF 结构域㊁1个PHY 结构域㊁2个PAS 重复结构域㊁1个组氨酸激酶A 结构域和1个类组氨酸激酶ATP 酶结构域㊂氨基酸序列同源性分析发现,二者与高粱PHYC
同源性最高㊂在拟南芥中过量表达ZmPHYC1和ZmPHYC2可以互补红光下拟南芥phyC -2突变体的长下胚轴表型,并且在持续红光和蓝光条件下均能促进幼苗的去黄化反应,在避荫条件下抑制下胚轴的伸长生长㊂在促进幼苗的去黄化反应和抑制避荫反应方面,ZmPHYC1的作用优于ZmPHYC2㊂
关键词:玉米;拟南芥;光敏色素C ;去黄化反应;避荫性
中图分类号:S513㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2021)01-0016-11
Cloning and Function Verification of Two Phytochrome
C Genes in Zea mays
DING Wusi 1,CHEN Shizhan 1,LIU Lei 1,FAN Xiaocong 1,DING Mengyue 1,
SUN Guanghua 1,WANG Lijian 1,2,YANG Jianping 1
(1.College of Agronomy,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,China;
2.Henan Police College,Zhengzhou 450046,China)
Abstract :In order to study the similarities and differences of PHYC functions between maize and
Arabidopsis and the functions in photomorphogenesis and shade avoidance of two maize PHYC genes,we cloned two maize PHYC genes,analyzed the functional domains of maize PHYC and phylogenetic tree of PHYC proteins maize and common plant species by bioinformatics,and verified the functions of two maize
PHYC genes in Arabidopsis by transgenic techniques.The results showed that the coding regions of ZmPHYC1and ZmPHYC2from maize inbred line B73were cloned.The coding region length was 3405bp,and encoded a protein with 1135amino acid residues with molecular weight of 126.14ku and 126.07ku.
Similar to the PHYC proteins of Arabidopsis and rice,ZmPHYC1and ZmPHYC2contained a PAS _2domain,a GAF domain,a PHY domain,two PAS repeat domains,a histidine kinase A domain and a histidine kinase like-ATPase domain.Amino acid sequence homology analysis showed that ZmPHYC1and
ZmPHYC2had the highest homology with the sorghum PHYC protein.ZmPHYC1and ZmPHYC2could
㊀第1期丁武思等:2个玉米光敏色素C基因的克隆及功能验证
not only complement long hypocotyl phenotype caused by Arabidopsis phyC-2mutant under red light,but also promote the de-etiolation of seedlings under continuous red and blue light conditions,and inhibit the elongation of hypocotyl under shade condition.For promotion of seedling de-etiolation and inhibition of shade avoidance,ZmPHYC1play more important role than ZmPHYC2.
Key words:Zea mays;Arabidopsis thaliana;Phytochrome C;De-etiolation;Shade avoidance
㊀㊀玉米(Zea mays)是世界上总产量最高的粮食作物,其总产量占全球谷物总产量的37.2%[1]㊂随着食品㊁饲料和工业产品对玉米需求量的递增,提高玉米单产显得十分必要[2-4]㊂耐密品种可以有效提高玉米单产,在过去的几十年里,耐密玉米品种的推广对美国和我国等国家的玉米持续增产做出了重要贡献[5-8]㊂但是随着种植密度的增加,植株间相互遮挡,造成光照不足,玉米出现徒长㊁茎叶夹角变小㊁早花㊁倒伏甚至空秆等避荫性综合反应(Shade-avoidance syndrome,SAS)[9-13],严重制约玉米单产的进一步增加㊂环境中光照的变化能显著影响玉米的株型㊁开花期㊁产量和品质等[14-19]㊂因此,探索自然界光能高效利用是进行玉米产量和品质改良的重要途径[14]㊂
植物通过光受体感知光质㊁光强和光照节律的变化,及时调控自身的生长与发育进程㊂植物的光受体主要分为三大类,即红光及远红光(600~750nm)受体光敏色素(Phytochrome,PHY),蓝光及UV-A(320~ 500nm)受体隐花色素(Cryptochrome)和向光素(Phototropin)㊁UV-B(282~320nm)受体等[20-22]㊂其中,光敏色素类蛋白通常形成同源或异源二聚体,其N 端形成的疏水区以共价键的方式结合线性四吡咯生色团,负责感受光的变化;C端负责信号传递及核定位,是2个光敏色素分子形成二聚体所必需的结构区段[23-24]㊂光敏色素参与调节植物从萌发到成熟的整个生长发育过程,也参与昼夜节律生物钟调控[25-26]㊂研究玉米光敏色素在光形态建成中的功能,可为改善玉米株型㊁提高玉米产量奠定理论基础㊂
模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)包含5个PHY基因,PHYA PHYE[27-28],对拟南芥光敏色素的研究较深入,但主要集中在PHYA和PHYB上, PHYC㊁PHYD和PHYE的研究相对薄弱㊂按照光敏色素在光照条件下的稳定性,可以将它们分为光不稳定型和光稳定型[29]㊂其中,PHYA属于光不稳定型,是最主要的远红光受体,介导远红光高辐照反应(Far-red-high-irradiance responses,FR-HIRs)和极低辐照反应(Very-low-fluence responses,VLFRs); PHYB㊁PHYC㊁PHYD和PHYE属于光稳定型,是主要的红光受体,介导低辐照(Low-fluence responses,LFRs)反应,并且PHYB起主导作用[30-31]㊂与野生型相比,phyC突变体幼苗对持续红光的敏感性降低,表现出下胚轴变长和子叶变小;在拟南芥中,尽管PHYC含量不高,但却参与了植株弱红光下幼苗的去黄化和子叶增大,同时也是短日照条件下的开花抑制因子[32-33]㊂
在禾本科植物中,光敏色素基因只有3个亚家族:PHYA㊁PHYB和PHYC[14]㊂玉米的远古种基因组经过了四倍体化的过程,由2个相近的禾本科物种杂交而来,而每个物种都携带一套PHYA㊁PHYB 和PHYC,随后的去四倍体化过程中光敏色素基因并没有被去除,导致玉米基因组有3对光敏色素基因PHYA1㊁PHYA2,PHYB1㊁PHYB2,PHYC1㊁PHYC2[34]㊂水稻(Oryza sativa)PHYC基因参与光形态建成的调节,phyA/phyB/phyC三重突变体黄化反应极强,且胚芽鞘和叶片增长[35]㊂另外,PHYC基因能抑制水稻在长日照条件下的开花,水稻phyC突变体在长日照条件下提前7d开花,phyA/phyC双突变体的开花期更加提前[35-36]㊂在小麦(Triticum aestivum)中, phyC突变体在长日照和短日照条件下分别推迟开花108d和19d[37]㊂近期的研究表明,ZmPHYB1和ZmPHYB2可以促进玉米的生长,增加玉米生物量和产量[38]㊂
在玉米中,对于PHYC的研究相对滞后,它们在玉米生长发育过程中的功能尚不清楚㊂ZmPHYC1和ZmPHYC2对各种光质和光周期处理均有较强的响应,推测二者在调控玉米光形态建成和开花中具有重要作用[26],但其具体功能尚不清楚㊂为此,克隆玉米的2个PHYC基因,转化拟南芥phyC-2突变体和野生型Col-0,对ZmPHYC1和ZmPHYC2进行功能验证,并探讨玉米与拟南芥PHYC功能的异同,以及ZmPHYC1和ZmPHYC2二者在光形态建成和避荫性反应中作用的差异,从而为玉米的开花期㊁株型和产量等重要农艺性状的改良提供新的策略㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀材料
1.1.1㊀试验材料㊀玉米自交系B73由李新海博士
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河南农业科学第50卷
赠送㊁杨建平实验室繁育并保存,拟南芥突变体phyC-2由美国加州大学伯克利分校Peter QUIAL 教授赠送,拟南芥哥伦比亚野生型(Col-0)㊁大肠杆菌DH5α感受态㊁农杆菌GV3101感受态和植物表达载体pJIM19-Myc由杨建平实验室繁育并保存㊂1.1.2㊀试验试剂㊀快速质粒小提试剂盒(DP105-03)㊁琼脂糖胶回收试剂盒(DP209-03)㊁反转录试剂盒(KR106-02)和通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214-03)均购于天根生化科技公司;Trizol试剂盒(Invitrogen,USA)购于赛默飞世尔试剂公司;限制性内切酶购于NEB公司;无缝克隆ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(C113)购于诺唯赞生物科技公司;2ˑKOD One PCR酶反应混合液购于ToYoBo公司㊂
1.2㊀试验方法
1.2.1㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白理化性质、结构域预测与系统进化分析㊀使用ProtParam网站(/protparam)对ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白的分子质量和等电点等进行分析,并且使用SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析其结构域;用DNAMAN(Version8.0)软件对这2个蛋白质以及二穗短柄草(Brachypodium distachyon)㊁水稻和拟南芥的PHYC蛋白结构域进行序列比对;利用NCBI网站(http://blast.ncbi. /)获得模式植物拟南芥PHYA PHYE 蛋白,其他双子叶植物番茄(Solanum lycopersicum)㊁马铃薯(Solanum tuberosum)㊁葡萄(Vitis vinifera),禾本科植物小麦(Triticum aestivum)㊁大麦(Hordeum vulgare)㊁黑麦(Secale cereal)㊁燕麦(Avena sativa)㊁二穗短柄草㊁水稻和高粱(Sorghum bicolor)的PHYC蛋白序列㊂然后利用MEGA-X软件使用Neighbor-joining(NJ)法进行系统进化分析,设置Bootstrap值为1000㊂
1.2.2㊀RNA提取及cDNA合成㊀采用Trizol试剂盒提取玉米B73叶片的总RNA㊂RNA样品溶于DEPC水中,然后按照反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA,储存于-80ħ备用㊂
1.2.3㊀2个ZmPHYC基因的克隆及载体构建㊀玉米自交系B73光敏色素ZmPHYC1(Zm00001d034038-T002)和ZmPHYC2(Zm00001d013262-T001)(MaizeGDB,http:// /)的编码区序列(Coding sequence,CDS)扩增引物采用Primer Premier5.0软件设计,引物序列(ZmPHYC1-F/ZmPHYC1-R和ZmPHYC2-F/ZmPHYC2-R)见表1㊂扩增ZmPHYC1和ZmPHYC2基因所用的PCR反应体系(20μL):7μL的无菌水,10μL的2ˑKOD One酶反应混合液,1μL的2.5mmol/L上游㊁下游引物, 1μL的cDNA㊂PCR反应程序:94ħ5min;94ħ30s,58ħ30s,72ħ4min,35个循环;72ħ2min;16ħ保存㊂反应结束后,将样品从PCR仪中取出,再用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离㊂电泳结束后,在凝胶成像仪中观察凝胶并拍照,切下目的基因片段,利用无缝克隆试剂盒将其连接到植物表达载体pJIM19-Myc,得到pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-Myc-ZmPHYC2,测序正确后备用㊂
表1㊀玉米2个PHYC基因克隆及转基因植株PCR检测引物
Tab.1㊀Primers for cloning two PHYC genes in maize and PCR detection of transgenic plants
引物名称
Primer name引物序列
Primer sequence Tm/ħ目的片段长度/bp Length of target fragment
ZmPHYC1-F5ᶄ-ACGGGGGACTCTTGACCATGGGCATGTCGTTGCCGTCGAACAA-3ᶄȡ723405 ZmPHYC1-R5ᶄ-AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTGAATTTACTCGTCGAAGGCT-3ᶄȡ72 ZmPHYC2-F5ᶄ-ACGGGGGACTCTTGACCATGGGCATGTCGTCGCCGTCGAAC-3ᶄȡ723405 ZmPHYC2-R5ᶄ-AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTGAATTTACTTGGCGAAGGCTT-3ᶄȡ72 ZmPHYC1-PF5ᶄ-GAATTCATGTCGTTGCCGTCGAACA-3ᶄ692000 ZmPHYC1-PR5ᶄ-CTCGAGAGATGGAGCTTTTACAATG-3ᶄ69 ZmPHYC2-PF5ᶄ-GAATTCATGTCGTCGCCGTCGAACA-3ᶄ712000 ZmPHYC2-PR5ᶄ-CTCGAGAGATGGAGCTTTTACAATG-3ᶄ69
1.2.4㊀拟南芥转化及鉴定㊀将测序正确的pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-Myc-ZmPHYC2电击转化到农杆菌GV3101中,然后利用浸花法转化到拟南芥野生型Col-0和phyC-2突变体中,得到pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-Myc-ZmPHYC2的T1种子,分别点播在含卡那霉素和除草剂草铵膦(Glufosinate ammonium)的MS培养基中,将T1转基因单拷贝株系(符合孟德尔遗传规律,表现为存活ʒ死亡=3ʒ1)幼苗移栽到营养土中并在温室中培养,经过3代筛选得到纯合株系种子用于后续试验㊂转
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㊀第1期丁武思等:2个玉米光敏色素C基因的克隆及功能验证
基因阳性植株的鉴定采用卡那霉素和草铵膦抗性平板筛选结合特异引物PCR检测法,引物序列(ZmPHYC1-PF/ZmPHYC1-PR和ZmPHYC2-PF/ZmPHYC2-PR)见表1㊂以转基因拟南芥基因
组DNA为模板,进行PCR扩增,扩增所用的PCR 反应体系(总体积为20μL):7μL的无菌水,10μL 的2ˑKOD One PCR Buffer,1μL的2.5mmol/L上游㊁下游引物,1μL的DNA㊂PCR反应程序:94ħ5min;94ħ30s,58ħ30s,72ħ2min,35个循环;72ħ2min;16ħ保存㊂反应结束后,将样品从PCR仪中取出,然后用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离㊂电泳结束后,用凝胶成像仪观察并拍照㊂有2kb条带者即为阳性植株,无此条带者则为阴性植株㊂
1.2.5㊀光处理及幼苗下胚轴测定㊀种子前处理:将拟南芥野生型Col-0㊁phyC-2突变体和转基因单拷贝纯合株系的种子经消毒灭菌后于4ħ黑暗放置3d,点播在1/2MS培养基平板上,然后置于白光下4h诱导萌发㊂光处理:将播种后的1/2MS培养基平板分别放于黑暗(Dk)㊁持续远红光[FR,2.50μmol/(m2㊃s)]㊁红光[R,30μmol/(m2㊃s)]㊁蓝光[B,6.0μmol/(m2㊃s)]㊁白光[WL,30μmol/(m2㊃s)] 22ħ培养箱中生长4d㊂
下胚轴测量:将待测的幼苗摆放在1/2MS培养基平板上,用体式显微镜(OLYMPUS SZX7)观察并拍照,然后用Image View软件测量幼苗的下胚轴,测量约30株幼苗㊂
1.2.6㊀短日照和长日照处理㊀按照1.2.4方法将播有野生型Col-0㊁突变体phyC-2和转基因单拷贝纯合株系种子的1/2MS培养基平板置于短日照条件(Short day,SD,8h光照/16h黑暗)或者长日照条件(Long day,LD,16h光照/8h黑暗)的22ħ培养箱中生长6d,按照1.2.5方法测量下胚轴长度㊂1.2.7㊀避荫处理㊀种子前处理同1.2.4㊂避荫处理:将播有野生型Col-0㊁突变体phyC-2和转基因单拷贝纯合株系种子的1/2MS培养基置于22ħ白光(R/FR=6.480)培养箱中培养2d,然后分别在持续白光和白光+远红光[WL+FR,30μmol/(m2㊃s), R/FR=0.048]的22ħ培养箱中培养5d㊂下胚轴测量同1.2.5方法㊂
1.2.8㊀幼苗叶绿素含量测定㊀将前处理好的播有野生型Col-0㊁突变体phyC-2和转基因单拷贝纯合株系种子的1/2MS培养基平板置于持续红光的22ħ培养箱中生长4d,每个株系挑取3份,每份150株,置于1.5mL离心管中,迅速放入-196ħ液氮中㊂取出离心管用研磨棒充分研磨,加入300μL 的80%丙酮,黑暗放置2h,13200r/min离心,取250mL的上清液,加入750μL的80%丙酮定容,最后用微量分光光度计测量样品A647㊁A663㊂根据叶绿素计算公式计算叶绿素含量,叶绿素含量(μg/mL)= 18.71ˑA647+7.15ˑA663,然后计算每株幼苗的叶绿素含量㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2基因的克隆及植物表达载体的构建
以玉米自交系B73的cDNA为模板扩增ZmPHYC1和ZmPHYC2基因片段,然后连接到植物表达载体pJIM19-Myc,经测序验证成功构建了ZmPHYC1和ZmPHYC2基因的植物表达载体,如图1所示
㊂
图1㊀pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-
Myc-ZmPHYC2植物表达载体的构建
Fig.1㊀The constructions of binary plasmid of pJIM19-Myc-ZmPHYC1and pJIM19-Myc-ZmPHYC2
2.2㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白结构域及系统进化分析
通过RT-PCR得到玉米2个ZmPHYC1和ZmPHYC2基因的CDS,二者均为3405bp,利用NCBI网站预测其编码1135个氨基酸残基的多肽,利用ExPASy网站预测二者分子质量分别为126.14ku 和126.07ku,理论等电点分别为5.89和5.93㊂利用NCBI网站对ZmPHYC1和ZmPHYC2以及二穗短柄草㊁水稻和拟南芥的PHYC蛋白结构域进行分析,同时进行多重序列比对分析发现,ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白具有高度保守的结构域,包括1个PAS_2结构域㊁1个GAF结构域㊁1个PHY结构域㊁1个组氨酸激酶A(Histidine kinase A domain,HisKA)结构域和1个类组氨酸激酶ATP(三磷酸腺苷)酶结构域(Histidine kinase like-ATPase domain,HATPase)(图2)㊂系统进化分析(图3)表明,ZmPHYC1与ZmPHYC2的氨基酸一致性最高(94%),与高粱的PHYC一致性较高(93%)㊂禾本科中的普通小麦㊁黑麦㊁大麦与水稻的PHYC亲缘关系相对较近,它们与玉米㊁高粱PHYC蛋白处于不同的分支㊂
2.3㊀转基因单拷贝纯合拟南芥株系的筛选
将构建好的pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-Myc-ZmPHYC2两种重组质粒分别转入拟南芥野生
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型Col -0和phyC -2突变体,T 1转基因株系草铵膦抗性分离比例表现为3ʒ1,即为单拷贝插入,自交到T 3,得到纯合转基因株系㊂为了确定转基因纯合株系的真实性,利用ZmPHYC1和ZmPHYC2基因特异
引物对纯合阳性株系进行PCR 鉴定㊂阳性转基因植株可见2kb 的条带(图4),而野生型Col -0㊁phyC -2及
阴性植株则无此条带
㊂
ZmPHYC1:XP_008665426.1;ZmPHYC2:NP_001131622.1;BdPHYC:NC_016131.3;OsPHYC:XP_015630523.1;AtPHYC:P14714
图2㊀4个PHYC 蛋白的功能结构域
Fig.2㊀Function domains of four PHYC proteins
2.4㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2基因在拟南芥中的功能验证
2.4.1㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2基因红光下对拟南芥phyC -2突变体表型的互补分析㊀将Col -0㊁phyC -2㊁
Myc -ZmPHYC1/phyC -2(株系#3㊁#5)㊁Myc -ZmPHYC2/phyC -2(株系#7㊁#15)分别在黑暗或持续红光条件下生长4d,进行各株系下胚轴的长度比较
(图5)㊂在黑暗中生长的幼苗均呈现典型暗形态建
2
㊀第1期丁武思等:2个玉米光敏色素C
基因的克隆及功能验证
AtPHYA:P14712;AtPHYB:P14713;AtPHYC:P14714;AtPHYD:P42497;AtPHYE:P42498;AsPHYC:P06593;ZmPHYC1:XP_
008665426.1;ZmPHYC2:NP_001131622.1;SbPHYC:AAR33021.1;OsPHYC:XP_015630523.1;HvPHYC:ABB77851.1;TaPHYC -5A:AY672997;TaPHYC -5B:AY673000;TaPHYC -5D:AY672999;
BdPHYC:NC_016131.3;ScPHYC:ScWN7R01G236700;SlPHYC:Q9ZS62;StPHYC:M1BGQ7;VvPHYC:B9U4G4图3㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白与其他
植物PHYC 蛋白的系统发育分析
Fig.3㊀Phylogenetic analysis of ZmPHYC1and ZmPHYC2
proteins and PHYC proteins in other plants
成的表型,各株系间无明显差异,暗示PHYC 蛋白的主要功能具有光照特异性㊂由于PHYC 是红光的受体,phyC -2突变体在红光条件下表现为下胚轴长于野生型,增幅为24%㊂在红光条件下,ZmPHYC1和ZmPHYC2不但能互补phyC -2突变体的表型,而且这些转基因株系的下胚轴比野生型Col -0短18%~24%㊂以上结果表明,ZmPHYC1和ZmPHYC2基因与拟南芥PHYC 基因具有相似的功能
㊂
图4㊀PCR 鉴定阳性转基因拟南芥株系
Fig.4㊀PCR detection of positive transgenic
Arabidopsis
lines
图5㊀在红光条件下Myc -ZmPHYC1和Myc -ZmPHYC2转基因拟南芥株系表型(A )和下胚轴长度(B )变化
Fig.5㊀Morphology (A )and hypocotyl length (B )of overexpression lines of Myc-ZmPHYC1
and Myc-ZmPHYC2under red light
1
2
河南农业科学第50卷
2.4.2㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因拟南芥株系
在持续红光和蓝光下的表型分析㊀将Col -0㊁phyC -2㊁Myc -ZmPHYC1/Col -0(株系#1㊁#9)㊁Myc -ZmPHYC2/Col -0(株系#4㊁#11)分别在黑暗㊁红光㊁远红光和蓝光条件下生长4d,比较各株系的下胚轴
长度(图6)㊂在黑暗㊁远红光条件下,这些株系幼苗的下胚轴长度没有明显的差异,表明ZmPHYC1和ZmPHYC2对远红光没有明显响应㊂但在红光条件下,ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分
别比野生型Col -0短31.8%~42.9%和25.8%~
34.7%㊂值得注意的是,phyC -2突变体在蓝光下表型较弱,其下胚轴比野生型伸长10.4%,ZmPHYC1
和ZmPHYC2转基因株系在蓝光条件下下胚轴明显缩短,它们的下胚轴分别比野生型Col -0短36.0~37.8%和26.3~30.7%㊂并且无论在红光还是蓝光下,ZmPHYC1转基因株系下胚轴均短于ZmPHYC2
转基因株系
㊂
图6㊀不同光处理条件下Myc -ZmPHYC1和Myc -ZmPHYC2转基因拟南芥株系表型(A )和下胚轴长度(B )变化Fig.6㊀Morphology (A )and hypocotyl length (B )of overexpression lines of Myc -ZmPHYC1and Myc -ZmPHYC2
under different light conditions
2
2
㊀第1期丁武思等:2个玉米光敏色素C 基因的克隆及功能验证
2.4.3㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因拟南芥株系对短日照和长日照的反应㊀将Col -0㊁phyC -2㊁Myc -ZmPHYC1/Col -0(株系#1㊁#9)和Myc -ZmPHYC2/
Col -0(株系#4㊁#11)幼苗分别在短日照㊁长日照条
件下生长6d,然后比较各株系的下胚轴长度(图
7)㊂在短日照条件下,ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比野生型Col -0短41.7%~45.9%和34.4%~35.9%;在长日照条件下,
ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比
野生型Col -0短26.2%~30.2%和25.7%~27.9%㊂无论在短日照还是长日照条件下,ZmPHYC1转基因株系下胚轴均比ZmPHYC2转基因株系短;转基因株系下胚轴长度与野生型Col -0的差距在短日照条件下大于长日照条件下㊂这些结果表明,ZmPHYC1和ZmPHYC2响应长日照和短日照条件,而且对短日照的响应更强烈㊂另外,在长日照和短日照条件下,与野生型相比,这些转基因拟南芥株系叶柄缩短㊁叶片肥厚
㊂
图7㊀在短日照和长日照下Myc -ZmPHYC1和Myc -ZmPHYC2转基因拟南芥株系表型(A )和下胚轴长度(B )变化Fig.7㊀Morphology (A )and hypocotyl length (B )of overexpression lines of Myc-ZmPHYC1and Myc-ZmPHYC2
under short day and long day conditions
2.4.4㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因拟南芥株系对避荫条件的反应㊀
将Col -0㊁phyC -2㊁Myc -
ZmPHYC1/Col -0(株系#1㊁#9)和Myc -ZmPHYC2/Col -0(株系#4㊁#11)幼苗分别在正常白光条件下和在人工模拟遮荫条件下生长,比较各株系的下胚轴长度(图8)㊂在正常白光条件下,ZmPHYC1和
ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比野生型Col -0短14.1%~29.3%和29.1%~34.8%;而在人工模
拟遮荫条件下,ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比野生型Col -0短38.8%~46.8%和11.9%~23.8%㊂在人工模拟遮荫条件下,Myc -ZmPHYC1/Col -0株系#9的下胚轴比Myc -ZmPHYC2/Col -0株系#11短30%㊂可见,ZmPHYC1比ZmPHYC2可以更强烈地抑制植物的避荫反应㊂2.4.5㊀ZmPHYC1和ZmPHYC2转化拟南芥幼苗的叶绿素含量分析㊀
Col -0㊁phyC -2㊁Myc -
ZmPHYC1/Col -0(株系#1㊁#9)和Myc -ZmPHYC2/
Col -0(株系#4㊁#11)幼苗在持续红光下生长4d,转基因株系幼苗的叶绿素含量比野生型Col -0增加45%~57%(图9),暗示ZmPHYC1和ZmPHYC2
可以通过增加叶绿素含量来增强拟南芥幼苗的光合能力㊂
3
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河南农业科学第50
卷
图8㊀在白光和避荫条件下Myc-ZmPHYC1和Myc-ZmPHYC2拟南芥过量表达株系幼苗的表型(A)和下胚轴长度(B)变化Fig.8㊀Morphology(A)and hypocotyl length(B)of overexpression lines of Myc-ZmPHYC1and Myc-ZmPHYC2
under white light and shade
treatments
图9㊀红光下Myc-ZmPHYC1和Myc-ZmPHYC2
转基因拟南芥株系幼苗的叶绿素含量变化
Fig.9㊀Chlorophyll contents of overexpression lines of
Myc-ZmPHYC1and Myc-ZmPHYC2under red light 3㊀结论与讨论
光敏色素是植物主要的红光与远红光受体,调控植物的光形态建成和避荫性反应等㊂本研究克隆了玉米的2个PHYC基因,通过系统进化分析和结构域分析,发现玉米PHYC与高粱PHYC进化关系最近,而与麦类和水稻的PHYC进化关系较远㊂本研究还发现,玉米和高粱的PHYC蛋白聚为一类,小麦㊁大麦㊁黑麦㊁燕麦㊁二穗短柄草和水稻聚为一类,可见禾本科植物PHYC基因的进化至少有2个分支㊂ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白与拟南芥㊁水稻和二穗短柄草对应的PHYC蛋白具有相似的结构
域,表明PHYC特定的结构域在进化中是保守的㊂
本研究发现,在持续红光下ZmPHYC1和ZmPHYC2
不仅能互补拟南芥phyC-2突变体的表型,而且能
显著抑制拟南芥下胚轴伸长㊂可见,玉米的2个PHYC基因与拟南芥PHYC基因促进红光下的光形态建成的功能类似㊂
在拟南芥远红光信号途径中,PHYA促进光形
态建成,而PHYB以拮抗PHYA的方式来抑制幼苗
的去黄化[39-40]㊂拟南芥PHYC不参与远红光信号途径[33]㊂拟南芥的PHYA㊁PHYB和CRY1被认为以功能冗余或者相互叠加的方式参与蓝光信号途径[40-41]㊂尽管拟南芥phyC突变体对蓝光反应很弱,但是与其他光敏色素一起协同参与蓝光信号途径[32]㊂ZmPHYC1和ZmPHYC2的过量表达株系,不能响应远红光,却能强烈地响应蓝光处理,因此二者在蓝光信号途径中的作用值得进一步研究㊂尽管拟南芥phyC突变体在持续的红光下表现出下胚轴伸长和子叶变小,但是与phyB突变体相比,phyB/phyC 双突变体的黄化反应的表型未见明显差异,可见拟南芥对红光的反应主要由PHYB介导[33]㊂近期的研究表明,拟南芥㊁小麦和水稻等植物中的PHYC 均能介导幼苗的去黄化反应和参与植物开花调控[33-37]㊂然而拟南芥和水稻的PHYC不能形成同
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㊀第1期丁武思等:2个玉米光敏色素C基因的克隆及功能验证
源二聚体,需要借助PHYB形成异源二聚体从而介
导幼苗光形态建成,但小麦PHYC既能形成异源二
聚体,也能形成同源二聚体,在红光下进入细胞核介
导光形态建成[30,35,37]㊂本研究结果表明,ZmPHYC1和ZmPHYC2响应各种光质及光周期处理,推测二
者在玉米光形态建成和开花期的调控中起重要
作用㊂
由于植物叶片含有的叶绿素等主要吸收红光,
导致透过上层叶片后的光线中,红光与远红光比率
下降,下层的植物能感受到这种光照的变化,从而触
发避荫性反应,造成植株徒长㊁茎秆纤细㊁开花提前㊁
易倒伏㊂茎秆徒长造成的营养再分配可能导致减
产,甚至绝收[13]㊂近些年来,玉米产量有了较大的提升,其中耐密品种做出了重要贡献[6-8],目前已选出适合高密植的品种,但绝大部分是增加了对低光的忍耐水平,而非是消除了避荫性[14]㊂在人工模拟的避荫条件下,过量表达ZmPHYC1和ZmPHYC2的转基因株系均比野生型表现出抑制下胚轴伸长,尤其是ZmPHYC1的转基因株系㊂可见,ZmPHYC1和ZmPHYC2能参与植物的避荫性调节,ZmPHYC1可能起到更关键的作用㊂另外,过量表达ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系在长日照和短日照条件下均能导致叶柄缩短和叶片肥厚,并且可以增加转基因植株的叶绿素含量㊂可见,研究ZmPHYC基因在密植条件下玉米光信号的避荫反应机制,使玉米株高降低,对培育耐密植㊁抗倒伏玉米新品种具有重要意义㊂
参考文献:
[1]㊀BAO B W,ZE C L,XIN L,et al.Genome-wide selection
and genetic improvement during modern maize breeding
[J].Nature,2019,413(2):383-389.
[2]㊀李存玲,李栓曹,邬勃,等.对我国玉米产业发展的思
考[J].安徽农学通报,2017,23(19):31-33.
LI C L,LI S C,WU B,et al.Thoughts on the development
of maize industry in China[J].Anhui Agronomy
Bulletin,2017,23(19):31-33.
[3]㊀李少昆,王克如,谢瑞芝,等.实施密植高产机械化生
产实现玉米高产高效协同[J].作物杂志,2016(4):
1-6.
LI S K,WANG K R,XIE R Z,et al.High yield and high
efficiency coordination of high yield and high efficiency in
maize by implementing close planting and high yield
mechanized production[J].Crops,2016(4):1-6. [4]㊀商彩霞.我国玉米生产现状及发展趋势[J].农业与技
术,2017,37(6):175-177.
SHANG C X.Current situation and development trend of
maize production in China[J].Agriculture and
Technology,2017,37(6):175-177.[5]㊀LEE E A,TOLL M.Physiological basis of successful
breeding strategies for maize grain yield[J].Crop Sci,
2007,47(S3):202-215.
[6]㊀MAN B D,MUMM R H.Survey of plant density tolerance
in U.S.maize germplasm[J].Crop Science,2014,54
(1):157.
[7]㊀TOLL M,LEE E A.Yield potential,yield stability and
stress tolerance in maize[J].Field Crops Research,
2002,75(2/3):161-169.
[8]㊀TOKATLIDIS I S,KOUTROUBAS S D.A review of maize
hybrids dependence on high plant populations and its
implications for crop yield stability[J].Field Crops
Research,2004,88(2/3):103-114.
[9]㊀BOL H E,PLK E L,YAN M J,et al.Increased phytochrome
B alleviates density effects on tuber yield of field
potato crops[J].Plant Physiology,2003,133(4):1539-1546.
[10]㊀BOULY J P,SCH E,DION M,et al.Cryptochrome blue
light photoreceptors are activated through interconversion
of flavin redox states[J].Journal of Experimental
Botany,2007,282(13):9383.
[11]㊀CAR M,POSS M,SESS G,et al.Canopy shade causes a
rapid and transient arrest in leaf development through
auxin-induced cytokinin oxidase activity[J].Genes and
Development,2007,21(15):1863-1868. [12]㊀CAR L G,MAL J N,BRA S M.Molecular control of crop
shade avoidance[J].Current Opinion in Plant Biology,
2016,30:151-158.
[13]㊀CHAN S,AOYA G,MORE I,et al.Shade avoidance
responses are mediated by the ATHB-2HD-zip protein,a
negative regulator of gene expression[J].Development,
1999,126(19):4235-4245.
[14]㊀詹克慧,李志勇,侯佩,等.利用修饰光敏色素信号途
径进行品种改良的可行性[J].中国农业科学,2012,
45(16):3249-3255.
ZHAN K H,LI Z Y,HOU P,et al.The feasibility of
using modified phytochrome signaling pathway for variety
improvement[J].Scientia Agricultura Sinica,2012,45
(16):3249-3255.
[15]㊀WELL J L,PERR G,SCHRE M E,et al.Genetic
dissection of blue-light sensing in tomato using mutants
deficient in cryptochrome1and phytochromes A,B1and
B2[J].Plant Journal,2001,25(4):427-440. [16]㊀GILI L,PERR G,PALL P,et al.Manipulation of the
blue light photoreceptor cryptochrome2in tomato affects
vegetative development,flowering time and fruit
antioxidant content[J].Plant Physiology,2005,137
(1):199-208.
[17]㊀PLAT J D,FOO E,ELL R C,et al.Cryptochrome1
contributes to blue-light sensing in pea[J].Plant
Physiology,2005,139(3):1472-1482.
[18]㊀SHAR P,CHATT M,BURR N,et al.Cryptochrome1
regulates growth and development in Brassica through
alteration in the expression of genes involved in light
52
河南农业科学第50卷
phytohormone and stress signaling[J].Plant Cell
Environment,2014,37(4):961-977.
[19]㊀李红丹,闫蕾,孙蕾,等.玉米隐花色素CRY1b和
CRY2基因转录丰度对不同光质处理的响应[J].作
物学报,2018,44(9):1290-1300.
LI H D,YAN L,SUN L,et al.Response of CRY1b and
CRY2gene transcription abundance of maize
cryptochrome to different light quality treatments[J].
Acta Crops Sinica,2018,44(9):1290-1300. [20]㊀YANG Z H,LIU B B,SU J,et al.Cryptochromes
orchestrate transcription regulation of diverse blue light
responses in plants[J].Photochemistry and
Photobiology,2017,93(1):112-127.
[21]㊀SADANANDOM A,ÁDÁMÉ,OROSA B,et al.
SUMOylation of phytochrome-B negatively regulates
light-induced signaling in Arabidopsis thaliana[J].
Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America,2015,112(35):11108-11113.
[22]㊀LIU B,YANG Z H,LIN C T,et al.Signaling mechanisms
of plant cryptochromes in Arabidopsis thaliana[J].J
Plant Research,2016,129(2):137-148. [23]㊀BAE G,CHOI G.Decoding of light signals by plant
phytochromes and their interacting proteins[J].Annual
Review of Plant Biology,2008,59:281-311. [24]㊀SAKAMOTO K,NAGATANI A.Nuclear localization
activity of phytochrome B[J].Plant Journal,1996,10
(5):859-868.
[25]㊀廖祥儒,史海水,尚丹,等.植物中的光敏色素[J].生
物技术通讯,2004,15(1):95-97.
LIAO X R,SHI H S,SHANG D,et al.Phytochrome in
plants[J].Biotechnology Communications,2004,15(1):
95-97.
[26]㊀牛骧,郭林,杨宗举,等.2个玉米光敏色素C基因的
转录丰度对多种光质处理的响应[J].中国农业科
学,2017,50(12):2209-2219.
NIU X,GUO L,YANG Z J,et al.Response of
transcriptional abundance of two phytochrome C genes in
maize to various light quality treatments[J].Scientia
Agricultura Sinica,2017,50(12):2209-2219. [27]㊀SHARR R A,QUAIL P H.Novel phytochrome sequences in
Arabidopsis thaliana:Structure,evolution,and differential
expression of a plant regulatory photoreceptor family[J].
Genes and Development,1989,3(11):1745-1757. [28]㊀CLACK T,MATHEW S,SHARR R A.The phytochrome
apoprotein family in Arabidopsis is encoded by five
genes:The sequences and expression of PHYD and
PHYE[J].Plant Molecular Biology,1994,25(3):
413-427.[29]㊀LI J,LI G,WANG H.et al.Phytochrome signaling
mechanisms[J].Arabidopsis Book,2011,9:e0148.
[30]㊀SHARROCK R A,CLACK T.Heterodimerization of type
Ⅱphytochromes in Arabidopsis[J].Proceedings of the
National Academy of Sciences of the USA,2004,101
(31):11500-11505.
[31]㊀SHARROCK R A,CLACK T.Patterns of expression and
normalized levels of the five Arabidopsis phytochromes
[J].Plant Physiology,2002,130(1):442-456. [32]㊀FRANKLIN K A,DAVIS S J,STODDART W M,et al.
Mutant analyses define multiple roles for phytochrome C
in Arabidopsis photomorphogenesis[J].Plant Cell,2003,
15(9):1981-1989.
[33]㊀MONTE E,ALONSO J M,ECKER J R,et al.Isolation
and characterization of phyC mutants in Arabidopsis
reveals complex crosstalk between phytochrome signaling
pathways[J].Plant Cell,2003,15(9):1962-1980.
[34]㊀SHEEHAN M J,FARMER P R,BRUTNELL T P,et al.
Structure and expression of maize phytochrome family
homeologs[J].Genetics,2004,167(3):1395-1405.
[35]㊀TAKANO M,INAGAKI N,XIE X Z,et al.Distinct and
cooperative functions of phytochromes A,B,and C in the
control of deetiolation and flowering in rice[J].Plant
Cell,2005,17(12):3311-3325.
[36]㊀TAKANO M,HIROCHIKA H,MIYAO A,et al.Control
of plant flowering time by regulation of phytochrome C
expression:US7566815B2(United States Patent)[P].
2009-07-28.
[37]㊀CHEN A,LI C X,HU W,et al.Phytochrome C plays a
major role in the acceleration of wheat flowering under
long-day photoperiod[J].Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA,2014,111(28):
10037-10044.
[38]㊀WIES G,MANTESE A I,CASAL J,et al.Phytochrome B
enhances plant growth,biomass and grain yield in field-
grown maize[J].Annals of Botany,2019,123(6):1079-
1088.
[39]㊀ZHENG X,WU S,ZHAI H,et al.Arabidopsis
phytochrome B promotes SPA1nuclear accumulation to
repress photomorphogenesis under far-red light[J].
Plant Cell,2013,25(1):115-133.
[40]㊀SU L,HOU P,SONG M F,et al.Arabidopsis
phytochrome A(PhyA)and PhyB synergistically
promote seedling de-etiolation under red,blue and white
light conditions[J].International Journal of Molecular
Sciences,2015,16(6):12199-12212.
[41]㊀NEFF M M,CHORY J.Genetic interactions between
phytochrome A,phytochrome B,and cryptochrome1during
Arabidopsis development[J].Plant Physiology,1998,118
(1):27-35.
62
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